活体多光谱荧光成像应用实例（一）
前言
传统的活体光学荧光成像（FLI）采用一个激发滤光片和一个发射滤光片。这对于区分靶向信号、可能存在的报告基因信号以及自体荧光组织信号而言有着诸多局限。多光谱（MS）FLI 采用多个激发滤光片和单个发射滤光片，或单个激发滤光片搭配多个发射滤光片，可以产生独特的荧光区域或材料的光谱曲线。（1）因此，图像上每一个像素点的荧光组分可以由此来确认（图 1）。
为何选择活体多光谱荧光成像？
选择活体MS FLI 有两大原因：
1-在组织自体荧光的特定范围内对波长较短的报告基因进行成像时，可以抑制自体荧光背景信号。
2-在利用带有重叠谱的波长较长的报告基因（如 NIR）进行成像
时，可以抑制交叉反应对独特的报告基因实现清晰的检测。
为了了解这两大原因，首先有必要了解小鼠组织自体荧光的基础知识，及其在荧光光谱不同范围中的成像。下图 2 显示了在采用绿/红、蓝/绿滤光片和 NIR 滤光片组合（2）时小鼠组织典型的天然自体荧光特性。值得注意的是绿/红和蓝/绿滤光片表现出较高的组织自体荧光水平，但 NIR 滤光片成像表现出的组织自体荧光相对较少。在使用绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）等报告基因、异硫氰酸荧光素（FITC）和 Alexa 600 时应用MSFLI可以有效地减少组织自体荧光。而远红（650-700 nm）或近红外（NIR; 700-900 nm）荧光团作为替代方案，因为在此光谱范围内皮肤自发荧光作用较小，但需要多重滤光片（3）。这种方法可以同时检测多个分子标志物，例如 荧光细胞示踪报告探针和 荧光 蛋白酶活力报告探针等。此外，鼠类食物经常包含含叶绿素的植物材料，可能在低 NIR 光谱中产生强烈的自体荧光。多光谱成像常常用于抑制这种胃肠道（GI）自体荧光，避免因成像研究而将饲料更换为无紫苜蓿的鼠类饲料。
启动并采集
布鲁克系统采用“基于激发”的多光谱成像方式。其中，多个激发滤光片和单个发射滤光片被用来捕获“叠合图像”。对于包括基因荧光蛋白报告在内的大多数有机荧光团而言，激发光谱可以比发射光谱（图 3）提供更多的信息，而与基于发射的多光谱成像相比，基于激发的多光谱成像能够更好地捕获这些不同的信息。
系统共配置 28 个激发滤光片。在定义发射滤光片前，应该为给定的成像实验选择最佳激发滤光片。而为了更好地选择滤光片，事先比对用于成像的报告基因的激发光谱曲线的荧光光谱差异是非常有用的。在下方（图 4）Alexa 680 和 Alexa 700 的例子中，二者在 520 和 720 nm 之间的激发光谱存在明显差异。（了解 Alexa 680 和Alexa 700 滤光片选择和建模的完整内容，请查看网络研讨会： https://youtu.be/iEyLl3qAzpA)。
系统配置 6 个发射滤光片（535 nm、600 nm、700 nm、750 nm、790 nm 和 830 nm）。通常选择在波长最长的激发滤光片60 nm 内不重叠的发射滤光片。所选发射滤光片无需与荧光发射的峰值一致，滤光片应优先选择覆盖特异荧光光谱的激发滤光片。继续以 Alexa 680 和 700 成像为例，由于 535、600、700 和 750 nm 滤光片带宽范围与选定的激发滤光片范围（图 5）重叠，因此这里可以选择 790 nm 的滤光片。
在“捕获（Capture）”对话框中（图 6）中支持选择多个激发滤光片用于采集编程。应该把多光谱采集作为之后多光谱建模和/或分离实验方法的一部分进行。
