流式细胞仪的使用程序
流式细胞仪的使用程序
一．开机程序
1． 检查稳压器电源，打开电源，稳定 5 分钟。
2． 打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入 400ml 漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至 4/5 满（一般可用三蒸水，做分选必须用 PBS 或 FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3． 将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热 5－10 分钟。排出过滤器内的气泡。
4． 如果需要打印，打开打印机电源。
5． 打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6． 执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的气泡。
7． 分析样品时，先用 FACAFlow 或 PBS 进行 HIGH RUN 约 2 分钟。
注：做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个 50ml 离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)
1． 从苹果标志中选择 CELLQuest 见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2． 选取屏幕左列绘图工具中的 Dot plot，绘出一个或多个 Dot Plots（点图）。从 Dot Plot 对话框中选取 Acquisition 作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和 y 轴参数。
3． 选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram（直方图）。
4． 将此视窗命名后储存于 FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP 文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
注：本计算机中已设定两个模式文件：ACQ 和 EXP，储存于 FACStation G3\BDApplications \CELLQuest \EXP 文件夹中，ACQ 用于细胞 DNA 检测，EXP用于细胞表面标志分析。
三．用 CELLQuest 进行仪器的设定和调整
1． 从苹果画面中选取 CELLQuest，进入 CELLQuest 后在 File 指令栏中打开合适的获取模式文件。
2． 从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取 Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。将出现的 Acquisiton Control 对话框移至合适位置。
3． 从 Cytometer 指令栏中，开启 Detectors/Amps 、 Threshold 、Compensation、Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1，2，3，4 获得此四个对话框。
4． 在 Detectors/Amps 对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式 Lin 或对数模式 Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC 和 SSC 多以线性模式Lin 测量，且 DDM Param 选择 FL2，而 FL1, FL2 与 FL3 则以对数模式 Log 测量；分析细胞 DNA 含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以 Lin 进行测量，且 DDM Param 选择 FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3 等均以 Log 进行测量。
5． 放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于 RUN，流速可在 HIGH 或 LOW 上。
6． 在 Acquisiton Control 对话框中，选取 Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取 Pause，Restart 以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉 SETUP 前的“ ”。
7． 在 Detectors/Amps 对话框中，调整 FSC 和 SSC 探测器中的信号倍增度：PMT voltages（粗调）与 Amp Gains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC 点图内,且三群细胞合理分布。
8． 在 Threshold 对话框中选择适当的参数设定 Threshold，并调整Threshold 的高低，以减少噪音信号（细胞碎片）。一般做细胞表型时用 FSC－H 而做 DNA 时用 FL2－H。Threshold 并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。
9． 从屏幕左列绘图工具中选取 Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10．在 Detectors/Amps 对话框中，调整荧光检测器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。
11．在 Compensation 对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为 FL1+
FL2- 的细胞群却分布在 FL1＋ FL2＋区域内，则需调大 FL2－？％FL1 中的“？”，并从
FL1-FL2 点图中观察新的调整是否恰当
12．在 Status 对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready 为14.7mW，Standby 为 5mW；Laser current:正常值为 6Amps 左右。
13．调整好的仪器设定可在 Instrument Settings 对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可
注：本计算机中已有三个名叫储存于 FACStation G3 \BD
Applications\CELLQuest Folder \IMM-InstrSettings 及 FACStation G3
\BD Files\Instrument Settings Files \CalibFile 和 Mast-Cell-Set
的参数文件，前二者可用于分析人白细胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。
四．通过预设的获取模式文件进行样品分析
1． 从苹果标志中选择 CELLQUEST，新视窗出现后从 File 指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。
2． 从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取 Connect to Cytometer 进行电脑和仪器的连机。将出现的 Acquisiton Control 对话框移至合适位置。
3． 从 Cytometer 指令栏中选取 Instrument Settings，在其对话框中选择Open 以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按 Set 确定。
4． 在 Acquire 指令栏中，选择 Acquisition&Storage 决定储存的细胞数，参数，信号道数。其中 Resolution 在做细胞表面标志时选择 256，做DNA 时选择 1024。Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。
5． 在 Acquire 指令栏中，选择 Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排 tube1，2，3…的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于 FACStation G3\BD Applications \CELLQuest\IMM 和 DNA 文件夹中。文件根据日期命名。
6． 在 Cytometer 指令栏中，选择 Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察 events 计数。
7． 将样品试管放至检测区，在 Acquire Control 对话框中选取 Acquire 以启动样品分析测定。
8． 微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择 Acquire Control 对话框中Pause, Abort, 去除 Setup 前的“ ”，开始正式获取信号，存储数据。
9． 当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤 7，继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。
注：当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。
五．关机程序：
1． 从 File 中选择 Quit, 退出软件，选择 Don’t Save 至苹果屏幕。
2． 用 4ml 1：10 稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去约 2ml，在将样品架置于中位（vacuum is off），再 HIGHRUN 5 分钟（内管吸去 2ml）。
3． 改用三蒸水 4ml 作样品,同上处理。
4． 按 Prime 三次。
5． 此时仪器自动转为 STANDBY 状态，换 2ml 三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY”状态 10 分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。
6． 填写使用登记表。
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