PWP1在调控胚胎干细胞分化过程中起重要作用（二）
Pwp1是通过调控了下游哪些通路影响分化过程呢？通过对基因芯片筛选到的差异基因进行GSEA通路分析，发现Jak/Stat3和Wnt/β-Catenin信号通路显著改变。qRT-PCR和Western
blotting验证显著Stat3表达显著增加，同时其下游基因Klf4,c-Myc和Socs3的表达也显著增加。Wnt信号通路中的转录因子表达降低，而Gsk3β等该通路调控基因表达并没有显著变化。因此，Pwp1可能通过转录调控网络，特别是Jak/Stat3通路影响了ESCs细胞的全能性。
为了验证Jak/Stat3和Wnt/β-Catenin通路对ESCs分化的调控作用，研究人员分别用Jak/Stat3抑制剂AG490和Gsk3β抑制剂SB216763处理Pwp1
KD和对照细胞系。结果显示，AG490（30
uM）恢复了细胞的分化形态，而SB216763没有显著影响。mRNA和蛋白检测显示这两个通路基因没有变化。磷酸化检测显示STAT3在AG490处理后显著减少。为了更加深入的研究Pwp1调控Stat3的作用机制。研究人员在Pwp1
KD 细胞系中敲除了Stat3。结果显示，细胞分化抑制被消除了。因此，Pwp1可能是通过调控下游Stat3的表达而影响分化过程。
3. Pwp1是怎么样通过Stat3信号通路调控ESCs分化过程呢？
已有研究表明，WD-40蛋白调控了H3K4的甲基化过程。结果显示Pwp1
KD也减少了细胞中的H4K20me3的表达水平。Dox处理实验表明H4K20me3显著下调，免疫组化实验也验证H4K20me3在Pwp1
KD后显著下调。此外，PWP1 ChIP-seq鉴定到5,639个结合位点，与H4K20me3
ChIP-seq的结果一致。免疫共沉淀表明PWP1和H4K20me3能结合。ChIP-PCR结果显示，PWP1和H4K20me3都可以和Stat3
DNA序列上的上游的两个位点结合。因此，该结果表明通过与H4K20me3结合，PWP1靶定到Stat3的上游抑制了它的表达。
研究结论
该研究表明，Pwp1蛋白，在mESCs分化过程中扮演了重要的角色。通过表达谱芯片筛选，GSEA通路分析和后期实验验证找到了下游调控基因Stat3。进一步的ChIP-seq等实验表明PWP1与H4K20me3相互作用，结合到Stat3上游位点影响了Stat3的表达，最终影响了ESCs的早期分化过程。
个人点评
该研究是典型的基因功能分子机制研究。当我们想研究某一个基因在某个生物学过程中的作用时，第一步就是确认该基因引起的生物学表型。接下来一步就是下游功能基因的筛选，通过基因过表达和敲除细胞系，借助于高通量基因芯片或者二代测序手段，筛选下游差异表达基因。最后通过生物通路分析和实验验证工作来揭示某基因是怎么样具体通过调控了下游的基因，进而影响了某个生物学过程。而这样一种思路的研究一般能发表5分以上的高影响因子文章，因此非常值得大家借鉴参考。
原文出处：
Shen JW, Jia WW, Yu YY, Chen J, Cao XK, Du YH, Zhang XB, Zhu SC, Chen W, Xi JJ, Wei TY, Wang GY, Yuan DL, Duan T, Jiang CZ,Kang JH. Pwp1 Is Required for the Differentiation Potential of Mouse Embryonic Stem Cells Through Regulating Stat3 Signaling. Stem cells2015;33:661–673.
