PWP1在调控胚胎干细胞分化过程中起重要作用
胚胎干细胞具有自我更新和分化的全能性。但是，胚胎干细胞发育分化的分子机制目前还不是很清晰。研究胚胎干细胞调控机制有助于对胚胎的形成及胚胎发育相关的疾病有更深入了解。来自同济大学的研究人员通过在小鼠胚胎干细胞中研究一个WD-4蛋白——PWP1，为我们展现了该基因在调控胚胎干细胞分化过程中的重要作用。
研究思路
1.PWP1影响了胚胎干细胞发育过程的哪个阶段呢？
胚胎干细胞有着活跃的细胞增殖和自我更新活动。Pwp1作为细胞周期调节子，在胰腺癌中异常表达，为了探究Pwp1基因在胚胎干细胞中的影响，研究人员首先在胚胎干细胞（mESCs）和胚胎纤维母细胞（MEFs）中检测了Pwp1及全能性markers基因的表达。结果显示Oct4,Sox2和Nanog在MEFs中比mESCs中低，Pwp1在分化的ESCs中表达降低。为了研究Pwp1降低引起的细胞变化，研究人员构建了knowdown的ESCs细胞系shPwp1 A和shPwp1 B。结果显示，Pwp1 KD没有改变细胞的形态和碱性磷酸酶活性，多能性markers基因的表达没有明显变化，只有Rex1和Klf4表达上调。细胞增殖检测表明Pwp1 KD后也没有发生明显变化，mES二次克隆形成也没有在Pwp1 KD后有所抑制。因此，细胞中Pwp1 KD没有影响ESCs细胞的增殖或自我跟新过程。
既然Pwp1不影响ESCs细胞的增殖，那么是否会影响其分化过程呢？结果显示，Pwp1 KD后的细胞更偏向于保持在克隆形态，即ESC分化显著降低。qRT-PCR检测显示3个胚芽层相关基因的表达也明显低于对照。因此，Pwp1基因影响了ESCs细胞的分化过程。为了更严格的说明Pwp1的分化作用，研究人员在畸胚瘤模型进行了验证。结果过显示，Pwp1 KD后不能检测到明显的胚芽层。因此，Pwp1对mES 分化非常重要。
细胞周期和细胞凋亡也是mESCs自我更新的重要过程。Pwp1 KD是否影响了细胞周期和凋亡而影响细胞分化呢？结果显示，Pwp1 KD后细胞周期没有显著改变，PCNA蛋白水平也没有明显变化，细胞周期相关基因的mRNA和蛋白表达也没有变化。同时，细胞凋亡在Pwp1 KD后没有明显变化。因此，Pwp1不是通过细胞周期或凋亡影响mESC的分化过程。
2. PWP1通过影响哪些下游通路调控mESC细胞分化呢？
既然Pwp1 KD影响了ESCs的分化过程，那么，具体调控的基因是谁呢？研究人员选择了Aglient全基因组表达谱芯片（该服务由上海伯豪生物技术有限公司提供）作为筛选工具进行了检测。通过对EBDay 0, EBDay 3和EBDay 6的Pwp1 KD组与对照组比较差异基因，分别用GSEA筛选三个不同胚芽层基因后发现，中胚层和内胚层基因显著下调。同时，Pwp1 KD中的分化相关markers基因表达也显著比对照低。
Pwp1是通过调控了下游哪些通路影响分化过程呢？通过对基因芯片筛选到的差异基因进行GSEA通路分析，发现Jak/Stat3和Wnt/β-Catenin信号通路显著改变。qRT-PCR和Western blotting验证显著Stat3表达显著增加，同时其下游基因Klf4,c-Myc和Socs3的表达也显著增加。Wnt信号通路中的转录因子表达降低，而Gsk3β等该通路调控基因表达并没有显著变化。因此，Pwp1可能通过转录调控网络，特别是Jak/Stat3通路影响了ESCs细胞的全能性。
为了验证Jak/Stat3和Wnt/β-Catenin通路对ESCs分化的调控作用，研究人员分别用Jak/Stat3抑制剂AG490和Gsk3β抑制剂SB216763处理Pwp1 KD和对照细胞系。结果显示，AG490（30 uM）恢复了细胞的分化形态，而SB216763没有显著影响。mRNA和蛋白检测显示这两个通路基因没有变化。磷酸化检测显示STAT3在AG490处理后显著减少。为了更加深入的研究Pwp1调控Stat3的作用机制。研究人员在Pwp1 KD 细胞系中敲除了Stat3。结果显示，细胞分化抑制被消除了。因此，Pwp1可能是通过调控下游Stat3的表达而影响分化过程。
3. Pwp1是怎么样通过Stat3信号通路调控ESCs分化过程呢？
已有研究表明，WD-40蛋白调控了H3K4的甲基化过程。结果显示Pwp1 KD也减少了细胞中的H4K20me3的表达水平。Dox处理实验表明H4K20me3显著下调，免疫组化实验也验证H4K20me3在Pwp1 KD后显著下调。此外，PWP1 ChIP-seq鉴定到5,639个结合位点，与H4K20me3 ChIP-seq的结果一致。免疫共沉淀表明PWP1和H4K20me3能结合。ChIP-PCR结果显示，PWP1和H4K20me3都可以和Stat3 DNA序列上的上游的两个位点结合。因此，该结果表明通过与H4K20me3结合，PWP1靶定到Stat3的上游抑制了它的表达。
研究结论
该研究表明，Pwp1蛋白，在mESCs分化过程中扮演了重要的角色。通过表达谱芯片筛选，GSEA通路分析和后期实验验证找到了下游调控基因Stat3。进一步的ChIP-seq等实验表明PWP1与H4K20me3相互作用，结合到Stat3上游位点影响了Stat3的表达，最终影响了ESCs的早期分化过程。
