CST抗体 Western Blot常见问题与解答
1.Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或无特异性蛋白带）
2.Problem：信号弱（1-30秒的曝光后检测不到信号）
3.Problem：无着色
4.Problem：着色太浅
5.Problem：着色太深
6.Problem：不正确的染色
Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或无特异性蛋白带）
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Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或无特异性蛋白带） Cause：一抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度 Solution： 使用推荐的阻断剂和TBS/T稀释抗体并4℃孵育过夜。多克隆抗体使用5%的BSA；单克隆抗体使用5％的脱脂奶粉 Cause：化学 发光检测时没有使用相应的膜 Solution：使用高质量的nitrocellulose或 PVDF膜 Cause：膜阻断不足导致一抗或二抗产生大量的非特异性结合 Solution：用含5％脱脂奶粉的TBS/T在室温阻断1小时（不能超过一个小时） Cause：二抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度，或二抗的特异性差 Solution：一些二抗会与蛋白产生非特异性的结合。因此在检测中可加入一步二抗的对照试验，在没有一抗的情况下，直接加入二抗孵育。也可将二抗用含5％脱脂奶粉的TBS/T在室温下孵育1小时 Cause：配制试剂的用水水质不佳 Solution：在配制试剂时（尤其是 磷酸化抗体）使用Milli-Q或其它超纯的去离子水 |
Problem：不正确的染色
| Cause：底物反应时间太长 | Solution：减少底物反应时间 |
| Cause：一抗或二抗的浓度太高 | Solution：降低一抗或二抗的浓度2-3倍 |
| Cause：阻断不足 | Solution：延长阻断时间或提高 血清浓度 |
| Cause：切片的质量不好 | Solution：选用质量好的组织切片 |
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Problem：信号弱（1-30秒的曝光后检测不到信号） |
| Cause：一抗孵育不足 Solution：适当延长孵育时间（4℃孵育过夜） Cause：转膜不完全 Solution：转膜时采用更高的电压和更长的时间。也可采用预染的蛋白Marker 监控转膜的过程 Cause：阻断膜超时 Solution：阻断膜的时间不能超过1小时 Cause：蛋白的表达水平低于检测底限 Solution：在每孔中加入更多的蛋白；先采用免疫沉淀法富集蛋白；换用表达高的样本或细胞；检测前适当刺激蛋白的表达 Cause：二抗与一抗的结合率太低 Solution：提高二抗的浓度或换用与一抗匹配的二抗 Cause：配制试剂时发生交叉污染 Solution：重新配制各种试剂 |
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CST 免疫组化 疑难解答 |
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Problem：无着色 Cause：组织切片的质量不好或固定不足 Solution：更换好的组织切片 Cause：底物反应时间太短 Solution：延长底物反应时间，直至出现着色 Cause：不合适的一抗或二抗 Solution：更换一抗或二抗 Cause：没有执行抗原修复 Solution：执行抗原修复 Cause：试剂的配制不正确 Solution：重新配制试剂 Cause：蛋白表达太低 Solution：加入对照试验 |
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Problem：着色太浅 应时间太短 Solution：延Cause：底物反长底物反应时间 Cause：一抗的浓度太低或孵育不足 Solution：提高一抗的浓度（1:50;1:100） Cause：蛋白表达太低 Solution：加入对照试验 |
| Problem：着色太深 Cause：底物反应时间太长 Solution：减少底物反应时间 Cause：一抗或二抗的浓度太高 Solution：降低一抗或二抗的浓度2-3倍 Cause：切片的质量不好 Solution：选用质量好的组织切片 Cause：组织切片没有进行阻断 Solution：用含5％ 血清的阻断液阻断1小时 Cause：冲洗不完全 Solution：每次冲洗时间不低于5分钟 Cause：二抗与样本发生交叉反应 Solution：选用合适的二抗 |
推荐
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综述
