纸层析鉴定转氨基作用实验的关键步骤
（一）实验目的：
1、学习氨基酸纸层析的基本原理.2、掌握氨基酸纸层析的操作原理.（二）实验原理：
转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应,在转氨酶的催化下,氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用.转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径.氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上.各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：
α—酮戊二酸 + 丙氨酸
ALT
谷氨酸 + 丙酮酸
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物,加肝匀浆保温后,用纸层析法检查谷氨酸的出现,以证明转氨基作用.纸层析属于分配层析.以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相.有机溶剂与水不相溶,把预分离物质加到滤纸的一端,使流动溶剂经此向另一端移动,这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配.由于物质分配系数的差异,而使移动速度就不一样,在固定相中,分配趋势较大的组分,随流动相移动的速度就慢,反之,在流动相分配趋势较大的成分,移动速度快,最终不同的组分彼此分离,物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：
物质在一定的溶液中的分配系数是一定的,故比值Rf也相对稳定,因此在同一层析体系中
可用Rf值来鉴定被分离的物质.（三）实验材料与仪器：试剂：
1、0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液.
2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍.
3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔 细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml.
4 、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后,加磷酸盐缓冲液至100ml.
5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后,加磷酸盐缓冲液至50 ml.6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解.
7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后,放入分液漏斗中,震荡,静置24小时后分层,将下部酚层转移到瓶中备用.
仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗.
