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肠道菌群相关代谢物--氧化三甲胺TMAO生物学功能
氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide，TMAO）是一种肠源性的菌群相关代谢产物，其在宿主肝脏中合成，前体三甲胺（TMA）的生成离不开肠道菌群的参与。肠道中的部分菌群可产生三甲胺裂解酶，将直接饮食摄入或间接生成的胆碱、甜菜碱、肉碱类和TMAO转化为TMA，后者经门脉循环进入肝脏并被黄素单加氧酶(FMOs)氧化生成TMAO。TMAO具有疏水和亲水双重基团，可调节蛋白质活性和稳定性，增加泡沫细胞生成和抑制胆固醇逆向转运。最近的研究显示TMAO是包括心血管疾病在内的许多慢性疾病的潜在风险因子。本文将介绍TMAO代谢和功能以及和诸多疾病间的关联。
氧化三甲胺代谢
肠道微生物群将含有三甲胺基团的复合物代谢生成三甲胺(TMA)，并通过肝脏FMOs进一步氧化为TMAO。膳食-肠道微生物-肝脏共同组成了TMAO的生物合成途径。产生TMA的前体包括TMAO、胆碱、磷脂酰胆碱、肉碱、γ-丁基甜菜碱、甜菜碱、巴豆甜菜碱和甘油磷酰胆碱，这些在鱼、牛肉和鸡蛋中含量非常丰富。参与生成TMA的酶主要有四种：胆碱-TMA裂解酶(cutC/D)、肉碱单氧合酶(cntA/B)、甜菜碱还原酶和TMAO还原酶。此外cntA/B同源酶yeaW/X也可以利用肉碱、胆碱、γ-丁基甜菜碱和甜菜碱生成TMA。
肠道微生物群将含有三甲胺基团的复合物代谢生成三甲胺(TMA)，并通过肝脏FMOs进一步氧化为TMAO。膳食-肠道微生物-肝脏共同组成了TMAO的生物合成途径。产生TMA的前体包括TMAO、胆碱、磷脂酰胆碱、肉碱、γ-丁基甜菜碱、甜菜碱、巴豆甜菜碱和甘油磷酰胆碱，这些在鱼、牛肉和鸡蛋中含量非常丰富。参与生成TMA的酶主要有四种：胆碱-TMA裂解酶(cutC/D)、肉碱单氧合酶(cntA/B)、甜菜碱还原酶和TMAO还原酶。此外cntA/B同源酶yeaW/X也可以利用肉碱、胆碱、γ-丁基甜菜碱和甜菜碱生成TMA。
cutD是一种s-腺苷-甲硫氨酸激活酶，可激活cutC形一个甘氨酰基自由基。在cutC中，甘氨酰基从半胱氨酸中获取氢生成巯基自由基，并进一步从胆碱C1位捕获氢原子，导致分子重排产生TMA。CntA/B是一种双组分Rieske型加氧酶/还原酶，cntA/B将肉碱进行氧化，C-N键处被cntA/B裂解生成TMA和苹果酸半醛。人体肠道中预计有数百种菌株可表达cutC/D或cntA/B-yeaW/X。奇异变形杆菌是其中一种表达cutC/D的细菌，由于它可以在有氧和厌氧条件下生长，因此被用作筛选胆碱三甲胺裂解酶抑制剂的模型。cutC基因树与菌群物种树有很大的不同，例如，同一属的克雷伯氏菌的拓扑结构不尽相同（Figure 3D）。TMA经门脉循环进入肝脏并被黄素单氧化酶（FMOs）氧化生成TMAO。FMO3是肝脏中最丰富的酶，而FMO1和FMO2也可以催化TMA的氧化。部分FMO3基因功能缺失突变的患者体内累积的TMA会扩散全身，并通过汗液和呼吸释放，此遗传病称为鱼腥味综合症。此外，研究发现小鼠体内FMO3表达可受雄激素的抑制和雌激素的刺激。
TMAO与心血管疾病
TMA-TMAO通路是饮食、肠道微生物群、动脉粥样硬化和血栓形成风险之间的一种新的交叉。TMAO循环水平升高被证明可独立预测重大心脏不良事件的风险，包括心肌梗死、中风或经常规心脏危险因素干预后和肾功能衰竭引起的死亡。胆碱、甜菜碱和肉碱循环水平也被证明与心血管疾病的发生有关，并可预测重大不良心脏事件的风险，但它们对疾病的预后评估依赖于血清TMAO水平。TMAO如何促进动脉粥样硬化和血栓形成的机制已经在分子水平上进行了研究。TMAO激活血管平滑肌细胞和内皮细胞MAPK、NF-κB信号，导致炎症基因表达和内皮细胞白细胞的粘附。同时，TMAO还能激活NLRP3炎性小体。TMAO在体内可增加清道夫受体、CD36和SR-A1的表达，诱导巨噬细胞摄取更多修饰的LDL形成泡沫细胞。另外，TMAO降低胆汁酸合成所必需的两种关键酶CYP7A1和CYP27A1以及肝脏中多种胆汁酸转运蛋白(OATP1、OATP4、MRP2和NTCP)的表达，降低胆汁酸量，导致逆向胆固醇转运减少。此外， TMAO增加血小板细胞内质网钙的释放，从而导致血小板聚集和血栓形成。多种激动剂的刺激可导致血小板钙释放增加及活性增强，如ADP、凝血酶和胶原蛋白。
临床观察研究表明TMAO循环水平与血栓风险密切相关。补充胆碱会导致血浆TMAO水平升高和ADP依赖性血小板聚集反应增加。此外，血浆TMAO水平与血小板反应性增加之间存在剂量依赖关系。然而TMAO依赖的血小板反应性增加能够减弱低剂量阿司匹林诱导的血小板聚集减少，这表明所谓的阿司匹林耐药性可能部分归因于肠道菌群促进血栓前因子的生成。血浆TMAO水平升高也有助于解释使用传统预防心血管疾病药物（包括抗血小板药物）的个体心血管疾病风险升高的现象。尽管大量数据证明TMAO与心血管疾病之间的联系，但仍然存在许多亟待解决的问题。更重要的是，是否存在TMAO受体？如果确实存在其性质又是如何？这都需要进一步确定。TMAO的功能是作为改变蛋白构象的小分子（蛋白伴侣模拟物），可能不仅通过经典的受体-配体相互作用影响信号通路，也可能作为变构修饰物。此外，TMAO促炎及对血栓形成作用的确切机制还需详细的分子解释。TMAO前体TMA是通过GPCR微量胺相关受体5(TAAR5)检测发现，尽管TAAR5不识别TMAO，但 TMA与TAAR5具有高亲和力。另外，TMAO还可增强其他信号转导（细胞内钙信号转导，血小板反应性以及血管紧张素分泌后血压的持续升高等）。
多项临床研究表明，慢性心衰（HF）中TMAO可能通过部分增加心肌纤维化和伴随心肌舒张功能障碍影响HF易感性和发生风险。但问题是，在急性失代偿性HF中，TMAO与不良结局是否存在类似的关系。临床数据表明，将TMAO纳入风险模型结合临床评分可改善院内死亡率的风险分层。此外，血浆TMAO水平与N-末端proBNP水平同时使用可改善预后预测。
TMAO与肝病
胆碱被认为是一种必需营养物质，它可以影响肝脏脂质和胆固醇代谢等多个体内代谢过程，以及通过脂质第二信使和胆汁酸的肠肝循环参与信号转导。TMAO可通过不同的机制促进NAFLD的发展，比如TMAO在HFD小鼠中上调葡萄糖代谢并增加胰岛素抵抗，TMAO也可以通过增加血清炎性细胞因子CCL2的水平来促进胰岛素抵抗。TMAO还可通过减少胆固醇转化为胆汁酸来影响脂质代谢和胆固醇稳态。临床前及临床证据表明，肠道胆碱代谢生成的TMA和TMAO可导致脂肪肝疾病的发展。采用减少TMA和/或TMAO的策略可用于治疗或预防NAFLD。例如，胆碱的结构类似物3,3-二甲基-1-丁醇，通过抑制微生物TMA裂解酶从而抑制TMA产生，降低TMAO水平，降低高胆碱或左旋肉碱饮食小鼠的动脉粥样硬化风险。基于个体不同的微生物特征，3,3-二甲基-1-丁醇可能仅对一部分脂肪肝患者有效。因此，需要对NAFLD患者队列进行额外的分型，以确定全部还是部分NAFLD患者具有系统性TMAO升高的表型。
TMAO与肾脏疾病
大鼠模型研究表明肾功能与TMAO水平之间存在密切联系。在慢性肾病（CKD）相关代谢物研究中，TMAO首次见于透析、移植或晚期CKD的小队列研究中，但没有进一步发现。另一项临床研究中观察到TMAO高水平的CKD患者（定义为估计肾小球滤过率<60ml/min/1.73m2）与死亡风险显著增加（HR 1.93，95%CI 1.13-3.29）相关。小鼠模型中，长期喂养TMAO或胆碱可导致肾纤维化，同时肾小管损伤标志物如胱抑素C、磷酸化SMAD3和肾损伤分子1/微管蛋白比值增加。这些观察结果在多个CKD患者独立观察队列中得到了验证。
TMAO与二型糖尿病
TMAO也和二型糖尿病相关（T2DM）。T2DM小鼠（db/db）的循环TMAO水平比正常小鼠中高10倍。在人类T2DM患者中亦发现循环TMAO水平升高。T2DM还可增强TMAO和不良心血管事件的关联，包括死亡、心肌梗塞、心衰和不稳定型心绞痛。在T2DM、糖耐量受损、妊娠糖尿病或体重指数(BMI)>27的受试者中，可以观察到随着血清TMAO浓度升高，颈动脉内膜-中膜厚度增加，且独立于年龄、性别和内脏脂肪重量。目前TMAO影响T2D发病机制的机理并不明确。小鼠补充TMAO后，可观察到肝胰岛素信号通路的紊乱和脂肪组织免疫反应的增加。但是在T2DM患者中，更高的心血管风险也可能来自与TMAO代谢相关通路的改变。
TMAO与癌症
循环TMAO的升高与某些癌症的风险增加有关。一项妇女健康倡议观察研究表明，在绝经后维生素B12水平较低的妇女中，TMAO浓度越高，患大肠癌的风险越大。在全基因组系统分析中发现了TMAO和结肠直肠癌之间的紧密联系。另外，在代谢组学研究中观察到TMAO与侵袭性前列腺癌之间存在正相关。可见，TMAO与多种癌症关联的机制值得深入探讨。
微生物三甲胺裂解酶抑制剂
降低循环TMAO水平已引起人们的广泛关注，微生物和宿主肝酶都是减少TMAO产生的潜在靶标。在摄取含TMA的营养物后，不同的微生物酶系统参与TMA的生成。胆碱利用基因簇编码催化和调节多肽、胆碱TMA-裂解酶(CutC)和胆碱TMA-裂解酶激活酶(CutD)，现在已知的其他微生物酶系统包括肉碱单加氧酶(CntA/CntB和YeaW/YeaX)。胆碱类似物3,3-二甲基丁醇(DMB)已被发现对胆碱TMA裂解酶活性有抑制作用，DMB被开发为CutC的竞争性抑制剂，以减少TMAO的产生，从而减弱胆碱在动脉粥样硬化中的促进作用。该抑制剂对含有CutC的人肠道共生菌具有非致死性影响，能抑制培养的共生菌中TMA的产生，并能降低胆碱补充饮食的小鼠血浆TMAO水平。最重要的是，暴露于DMB也能减缓AopE-/-小鼠的动脉粥样硬化的发展。DMB是一种天然产物，主要分布在某些香醋、红酒、冷榨特级初榨橄榄油和葡萄籽油中。目前没有发现DMB对肝脏或肾功能有任何不良影响，甚至在小鼠饮水高达1%的情况下也没有发现。其他未被证实的潜在TMA抑制剂包括米曲肼（肉碱类似物，降低肉碱到TMA的转化）和白藜芦醇(不是抑制剂，但可改变肠道菌群组成降低TMAO)。
小结
TMAO和心血管疾病之间的联系已经在不同队列中进行了研究，除此之外，TMAO还会对慢性肾病肾功能不全和死亡风险、II型糖尿病、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝和某些癌症的发生发展产生影响。这些研究表明，TMAO循环水平有可能为TMAO相关疾病的干预提供一定的依据。针对TMAO生物合成途径，可以通过几个关键步骤来实现，包括通过摄入具有微生物酶抑制作用的营养物质抑制肠道TMA的代谢，控制摄入富含TMA前体的饮食，抑制肝脏中TMA向TMAO的转化。尽管许多研究指出血浆胆碱、氧化三甲胺和疾病之间存在联系，但现有研究数据仍不够充分，还需要进一步对TMAO展开系统的临床研究。
参考文献
1. Tang WHW, Li DY, Hazen SL. Dietary metabolism, the gut microbiome, and heart failure. Nat Rev Cardiol. 2018. doi: 10.1038/s41569-018-0108-7.
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3. Jonsson AL, Bäckhed F. Role of gut microbiota in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2016. doi:10.1038/nrcardio.2016.183.
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精彩回顾
2. Cell Metabolism | 肠道菌群相关代谢物--胆汁酸生物学功能
3. NATURE COMMUNICATIONS | 肠道菌群相关代谢物生物学功能解读—色氨酸代谢
