4D组学新时代!更精确的磷酸化修饰组学
离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D蛋白质组学是在3D分离即保留时间(retention time)、质荷比(m/z)、离子强度(intensity)这三个维度的基础之上增加了第四个维度,离子淌度(mobility)的分离(图1),进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度,带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。
对于磷酸化肽段的同分异构问题,通过图3可以进行很好的解释,图3中的两个同分异构体的磷酸化肽段,分子序列完全一样,只是发生磷酸化的位置不同。这些同分异构的磷酸化肽段在一级谱图上的质量完全相同,而在二级谱图上也高度类似。面对这样微小的差别,传统的质谱鉴定和搜库软件通常难以做明确的区分,这就会导致出现错误定位(false localization)的问题。因此在处理PTM质谱数据时,需要对修饰位点进行FLR的控制。目前针对FLR的控制仍是一个挑战,主要是通过多种评估软件或算法来进行打分,但这些都是统计估算层面上的方法,并没有在质谱鉴定水平上解决修饰位点准确定位的问题。
那么这种同分异构的现象是否普遍呢?最新的一项实验测试显示,对100ug HeLa细胞裂解液进行IMAC磷酸化修饰富集后,90min的单针检测共鉴定到18500个unique 磷酸化修饰肽段,其中6315个磷酸化肽段被鉴定为同分异构,比例达到26%(图4A)。进一步,研究者对这些同分异构的磷酸化修饰肽段在不同保留时间的分布比例进行分析,结果表明50%的同分异构体在15s的保留时间窗口被洗脱出来(图4B)。以上的实验结果表明,磷酸化修饰同分异构比例很高并且不能通过保留时间进行很好的区分,这也表明传统方法难以准确识别磷酸化位点。
令人激动的是,新一代的4D蛋白质组学除了在蛋白鉴定上有着卓越的性能,新增的离子淌度分离还能解决同分异构的问题,使得PTMs的鉴定更加可靠。图2中两个磷酸化肽段的同分异构体,尽管洗脱时间和质荷比完全一样,但是由于发生磷酸化的位置不同,所以在结构上会有差别,而4D蛋白质组学的离子淌度分离会根据碰撞截面(Collision Cross Section)大小的不同对同分异构进行区分并获得可靠的磷酸化肽段的鉴定。
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参考文献:
1. Heiner Koch, et al., The PASEFmethod on a TIMS-QTOF mass spectrometer for High Sensitivity Phosphoproteomics.ASMS 2018, TP 555
2. Christopher M. Adams, et al., Identification and Quantitation of Phosphopeptide PositionalIsomers using Trapped Ion Mobility Spectrometry and PASEF. ASMS 2019, WP 662