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Edman降解法N端测序在解析蛋白和多肽序列中的应用
2017生物制品年会昨天在成都落下帷幕，生物医药的创新发展是大会上各位专家学者的讨论热点，更是生物医药行业的研究热门，那么今天的小课堂我们就一起来了解一下生物药检测相关技术。
蛋白质的N端氨基酸序列是生物药的关键质量属性之一。Edman降解法N端测序是分析这一属性的常规方法。通过Edman降解法分析N端的15个氨基酸序列在生物药申报时通常是必检项目；同时也是很多已上市生物药的年检项目（见2015年版药典）。在科研中，对未知或者不确定理论序列的蛋白可以使用N端测序为确证提供关键信息。所以该方法在科研和工业中都有广泛的应用。那么它的原理、如何分析结果以及送样的一些注意事项是什么呢？
方法原理
简单来讲，从这两个方面来理解：
第一步，Edman降解：通过PITC（苯异硫氰酸酯）这种有机试剂和蛋白或多肽N末端的α-氨基反应，使得N端的第一个氨基酸从序列上断裂得到游离的PITC衍生氨基酸，同时暴露出序列中第二个氨基酸残基的α-氨基。
第二步，测序：断裂下来的PITC衍生氨基酸通过HPLC分离后根据保留时间来判断氨基酸的种类。
这样即完成一个循环，分析出了N端的第一个氨基酸。听上去很复杂？这一系列的工作都已有自动化的测序仪来完成的。如现在市面上通用的，同时也是唯一一家在产的，岛津的PPSQ-31A/33A型蛋白测序仪。
PPSQ-31A/33A型蛋白测序仪（SHIMADZU）
结果分析
自动化测序仪哗哗跑完了实验，这实验结果还得人工分析。那么，通常我们会遇到哪些结果呢？（以第一个循环为例）
一般针对一个纯度达到95%以上的蛋白样品，测序结果出来是这样的：
清清楚楚，一个Glu的峰。（DTT、DMPTU、DPTU为试剂峰）非常明确地表明所检测样品的N端第一个氨基酸是Glu。最喜欢看到这样的实验结果了！
不过也有不一般的情况，有以下两种：
图谱中有多个氨基酸的峰。这是样品纯度不够、或者样品有降解（还是纯度不够）时会出现的情况。（不信？拿样品跑一下HPLC，或者跑个SDS-PAGE胶，也可以用质谱测分子量都可以看出样品纯度问题。）
干干净净，一个氨基酸的峰也没有！有两种原因会导致这种情况：1. N端封闭即N末端氨基酸的α-氨基被修饰（如发生了乙酰化修饰，Glu环化成焦谷氨酸等）；2. 上样量太少，信号强度达不到检测线。
经过以上实例分析，下次拿到结果是不是再也不会蒙圈儿了呢？
最后，友情提示：
虽然有自动化的测序仪，但N端测序的速度相比核酸测序可要慢多了。所以，在送样前该如何对自己的样品进行一个预判，看其是否适合用此方法来分析N端序列呢？
常见问题 Q&A
1. N端测序对蛋白样品纯度有要求吗？
是的。纯度最好能达到95%以上；否则每个循环有多个氨基酸出峰，无法归属到蛋白的序列。
2. 蛋白有两条或者三条链，如何进行N端序列分析？
先进行SDS-PAGE电泳将条带分开，然后将胶上的蛋白转移到PVDF膜上，丽春红染色后，分别剪切下相应的条带进行测序。
这里有两点注意事项：转膜时不要使用Tris-甘氨酸缓冲液，其会在N端测序中产生较高的背景，推荐使用CAPS缓冲液。另外对PVDF膜染色时，不要使用考马斯亮蓝，应使用丽春红染色。
3．什么样的样品不适合用Edman降解法N端测序来分析序列？
第一，N末端封闭的样品：从反应原理可知，N末端的α-氨基被修饰后，反应无法进行；
第二，关注的N端序列中有太多非标准氨基酸，由于没有相应的标准品，也没有办法通过N端测序来分析。此时可改用质谱法进行序列确证。
以上就是本期小课堂的全部内容，下课！
