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Cancer Res|蛋白组学多组学肝癌患者肿瘤发生和转移机制研究

2019.6.09

肝细胞癌（HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率位居第六，死亡率位居第三。极易复发和转移导致了肝癌患者的高死亡率，因此针对肝细胞癌的发生和转移机制的研究迫在眉睫。本文为鹿明生物客户--四川大学肝胆外科研究室的科研者们于2019年5月发布在Cancer Res的研究文章：LncRNA SNHG10通过正反馈环调节其同源物SCARNA13促进肝癌发生和转移的研究，为肝细胞癌的发生和转移机制又进行了深入的研究。

基本信息

影响因子：9.130

技术：RNA测序（(RNA-seq）、qPCR 、TMT标记定量

期刊：Cancer Res

材料：肝癌患者肿瘤及配对癌旁组织、细胞系、BALB / c裸鼠

涉及鹿明产品服务：蛋白组学

研究背景

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是常见的恶性肿瘤之一，由于HCC发生和转移的分子机制尚未完全阐明，鉴定关键的促癌分子将有助于理解HCC发病机制和鉴定潜在的治疗靶点。长非编码RNA（Long noncoding RNAs (lncRNAs）属于一类超过200个核苷酸的RNA转录本，没有或具有低蛋白质编码潜力。越来越多的研究表明，lncRNA参与包括细胞分化、凋亡、免疫反应和致癌作用等多种生物调控过程[1]。主要在细胞核中发现的snoRNA (small nucleolar RNAs) 长度为60-300个核苷酸，可指导小RNA的转录后修饰。近期研究发现lncRNA和小RNA之间存在复杂的相互作用，其中一些lncRNA可以产生或调节小RNA[2]。作为小RNA的亚类，大多数snoRNA编码在SNHG (small nucleolar RNA host genes)的内含子中，而来自SNHG的初级RNA转录本外显子被剪接成lncRNA并转运到细胞质中，表明snoRNA与从SNHG转录的同源lncRNA之间可能存在潜在的相关性。本文作者对lncRNA和同源snoRNA之间的特定关系以及它们在HCC发生中的特定作用加以研究。

样本制备

雄性BALB / c裸鼠建立HCC肺转移模型，肺转移灶上最大的肿瘤进行原代培养以分离异种移植的HCC细胞。

图1 | 样本制备

实验结果

1. 作者通过RNA测序建立异种移植HCC细胞和亲本HCC细胞间的表达谱，并结合TCGA LIHC数据，筛选出24种lncRNA和6种snoRNA可能在HCC的肿瘤发生和转移中起关键作用。

图2 | 实验设计

其中SNHG10和SCARNA13是来自相同初级转录物的不同产物，即SCARNA13来自SNHG10基因的初级RNA转录物的内含子，而外显子被剪接成SNHG10转录本。因此SNHG10和SCARNA1成为作者主要关注的分子。

统计分析表明SNHG10和SCARNA13在肺转移灶以及HCC组织中升高，并且其高表达与HCC患者不良预后正相关。

2.体内和体外功能实验表明SNHG10可促进HCC细胞的肿瘤发生和转移。

3.SCARNA13可促进HCC细胞的肿瘤发生和转移。

4.转录因子c-Myb可上调SNHG10和SCARNA13水平。

5.SNHG10作为miR-150-5p的海绵(sponge)起到增加c-Myb表达的作用。

6.SNHG10通过miR-150-5p / RPL4-c-Myb正反馈环调节SCARNA13的表达。作者通过ChIPR-seq筛选出SNHG10可以结合RPL4 mRNA，并增加其稳定性从而提高其表达水平，同时RPL4可以结合C-Myb并增加其转录活性，最终形成一个正反馈环路，不断刺激SCARNA13的表达。

7.为了进一步鉴定SCARNA13的候选下游因子，作者使用TMT蛋白质组技术分析敲低SCARNA13后HCC细胞的蛋白变化，发现了182种差异表达的蛋白质，其中11种基因同时被转录组学和蛋白质组学检测出差异。

SOX9的蛋白质表达水平在 SCARNA13敲低后下调最显著。因此，作者选择SOX9作为SCARNA13的候选下游蛋白并加以验证。

大量研究表明，SOX9可对癌细胞的细胞周期和EMT产生影响[3-4]。因此，作者检测了敲低SCARNA13对细胞周期和EMT分子标志物表达的影响。结果发现在抑制SNU-387和HCCLM3细胞中的SCARNA13后，CDK2、CDK3、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3、ZEB1、波形蛋白、N-钙粘蛋白和纤连蛋白的表达水平显著下降。相反，用SCARNA13 ASO转染会导致HCC细胞中p21、p27和E钙粘蛋白的表达显着增加。

结论

结论：这些发现表明SNHG10对肿瘤发生和转移的促进作用是由SCARNA13介导的，其通过在HCC细胞中上调SOX9来促进细胞周期和EMT。

寄语

了解非编码RNA（ncRNA）在肿瘤发生和转移中的作用将为鉴定诊断分子和治疗靶点建立新的途径。本文目的为确定肝细胞癌（HCC）特异性ncRNA，并研究它们在HCC发生和转移中的作用。作者通过RNA-seq鉴定肺转移产生的异种移植HCC细胞，发现lncRNA SNHG10及其同源物SCARNA13可作为HCC发展和转移的新驱动因子。在64例HCC病例中，SNHG10表达与SCARNA13表达呈正相关，而SNHG10或SCARNA13的高表达预示着患者不良预后。由于SCARNA13在SNHG10过表达和敲低后显示出显著的上升和下降，作者假设SNHG10可能是SCARNA13的上游调节因子。功能实验发现SNHG10和SCARNA13协同促成HCC细胞的恶性表型，其中SNHG10充当miR-150-5p的海绵并与RPL4 mRNA相互作用以增加c-Myb的表达和活性。而上调和过度活化的c-Myb会调节SNHG10启动子活性从而增强SNHG10和SCARNA13的表达，形成正反馈循环并持续刺激SCARNA13表达。SCARNA13通过调节SOX9促进HCC细胞的细胞周期和上皮间质转化（EMT）。作者通过多种组学技术手段，发现了在HCC发生和转移过程中起重要作用的复杂调节网络。

参考文献

[1] Schmitt AM, Chang HY. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer cell 2016;29(4):452-63 doi 10.1016/j.ccell.2016.03.010.

[2] Lu Y, Zhao X, Liu Q, Li C, Graves-Deal R, Cao Z, et al. lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/beta-catenin signaling. Nature medicine 2017;23(11):1331-41 doi 10.1038/nm.4424.

[3] Cheng PF, Shakhova O, Widmer DS, Eichhoff OM, Zingg D, Frommel SC, et al. Methylation dependent SOX9 expression mediates invasion in human melanoma cells and is a negative prognostic factor in advanced melanoma. Genome biology 2015;16:42 doi 10.1186/s13059-015-0594-4.

[4] Liu C, Liu L, Chen X, Cheng J, Zhang H, Shen J, et al. Sox9 regulates self-renewal and tumorigenicity by promoting symmetrical cell division of cancer stem cells in hepatocellular carcinoma. Hepatology (Baltimore, Md) 2016;64(1):117-29 doi 10.1002/hep.28509.

关于鹿明（www.lumingbio.com）

上海鹿明生物科技有限公司（前身：成立于2009年的上海博苑生物科技有限公司），一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近10年的发展沉淀，公司建立起了 Labelfree、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台，并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。

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