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客户文章 | 北京大学口腔医院课题组利用LC-MS普筛发现补充益生菌可能对骨质疏松症有效的机制

2019.7.15

前言

2019年7月，北京大学口腔医院课题组在Therapeutic Advances in Chronic Disease（IF=4.45）发表题为“Lactobacillus rhamnosus GG attenuates tenofovir disoproxil fumarate-induced bone loss in male mice via gut-microbiota-dependent anti-inflammation”的研究论文，该研究报道了补充益生菌可能对骨质疏松症有效，本文作为此项研究的先导对其中的影响机制进行了进一步的探索。

基本信息

英文标题：Lactobacillus rhamnosus GG attenuates tenofovir disoproxil fumarate-induced bone loss in male mice via gut-microbiota-dependent anti-inflammation

中文标题：鼠李糖乳酸杆菌GG通过依赖肠道菌群的抗炎作用减轻富马酸替诺福韦二吡呋酯诱导的雄性小鼠骨质疏松

材料：小鼠粪便

影响因子：4.45

发表期刊：Therapeutic Advances in Chronic Disease

主要运用鹿明生物技术：LC-MS普筛

研究背景

观察发现抗逆转录病毒药物会引发感染免疫缺陷病毒患者的骨质流失，而富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）会引起严重的骨损伤，例如骨质疏松症。补充益生菌（例如Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）可能对骨质疏松症有效，但目前影响机制尚不清楚，本文对此进行了探索。

研究思路

（一）实验分组

6周大雄性小鼠，分为五组（每组10-12只），每组喂食不同药物，持续8周：

①对照组（Sham）：只服用生理盐水；

②LGG+TDF组：每日服用相同剂量（0.86 mg）TDF，一周两次服用固定剂量LGG；

③大肠杆菌++TDF组：每日服用相同剂量（0.86 mg）TDF，一周两次服用固定剂量大肠杆菌；

④阴性对照组（TDF组）：每日只服用相同剂量（0.86 mg）TDF；

⑤阳性对照（ZOL+TDF组）：前4周，每周1次皮下注射ZOL，每日服用相同剂量（0.86 mg）TDF。

（二）检测方法

① 显微CT、骨切片和弯曲测试评估骨形态测量和生物力学。

② 酶联免疫吸附试验，定量实时聚合酶链反应和流式细胞术检测淋巴细胞，促炎细胞因子和肠道通透性水平。

③ 16S重组脱氧核糖核酸焦磷酸测序分析肠道微生物群组成

④ 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析代谢组。

结果分析

1.服用LGG可减轻TDF引起的骨质流失

LGG + TDF组小鼠在8周时体重明显低于大肠杆菌+ TDF和TDF组。为了研究LGG在TDF诱导的骨质丢失中的作用，作者使用骨密度、骨形态测量以及显微CT评估骨质量和微结构，结果显示在表1和图1。在第8周LGG+TDF组显示出骨密度显著增加，骨形态测量和显微CT也验证了该结果，表明服用LGG可减弱TDF诱导的骨微结构破坏。

图1 | 骨密度、骨形态测量以及显微CT评估不同组别的差异

表1 | 第8周时5个实验组进行骨密度和骨组织形态学测定

作者为了进一步评估骨再生情况，通过显微CT和组织形态学测量了生长板厚度。结果显示（图2）LGG + TDF组中的生长板在五组中最厚（p <0.05）。此外LGG + TDF组生长板中的肥大软骨细胞数量多于其他组，表明LGG组发生更多软骨内骨化。此外与ZOL + TDF和Sham组相比，大肠杆菌+ TDF和TDF组的生长板明显更薄。使用双荧光标记的动态组织形态学分析也显示LGG + TDF组中的MAR和BFR / BS比率在五组中最高（p <0.05）。

图2 | 服用8周LGG后促进骨转换和软骨内骨化

生物力学是骨性评估的关键指标。生物力学参数的结果表明（图3）LGG + TDF组的最大载荷，极限载荷能量，杨氏模量、刚度和断裂能量与大肠杆菌+ TDF或TDF组相比显着增加（p < 0.05）。

图3 | 服用LGG8周时改善另外血清骨转换指标和生物力学特性

2. LGG可防止破骨细胞生成并调节骨髓的免疫应答

为了确定骨质流失是否与破骨细胞生成相关，进行TRAP染色和ELISA分析。结果表明，与大肠杆菌+ TDF和TDF组相比，LGG + TDF、Sham和ZOL + TDF组的N.Oc / BS和Oc.S / BS显著降低（p <0.05）。此外与大肠杆菌+ TDF和TDF组相比，LGG + TDF和ZOL + TDF组的骨髓细胞上清液的RANKL水平也显著降低（p <0.05）。为了探索破骨细胞生成是否与炎症有关，进行了ELISA和FACS分析，发现与大肠杆菌+ TDF和TDF组相比，LGG + TDF组细胞上清液中TNF-α和IL-17的浓度显著降低（p <0.05）。

图4 | 不同组的染色、ELISA分析、FACS分析结果

3. LGG调节肠道炎症反应和肠道渗透性

为研究LGG诱导的全身炎症反应，检测血清促炎细胞因子和脾脏淋巴细胞。与大肠杆菌+TDF和TDF组相比，LGG+TDF组显着增加Treg:CD4+T细胞和Treg:Th17细胞的比例，以及Th17:CD4+T细胞比例降低（p <0.05）。为研究肠道炎症反应是否引发全身炎症反应，作者进行了组织学、qPCR和FACS分析。实验结果表明肠道炎症状态与肠道通透性的变化有关。Claudin蛋白（CLDN）在间隙连接蛋白合成中起关键作用，这对于肠道屏障的生理紧缩非常重要。

图5&6 | LGG调节系统炎症反应和肠道渗透性

4. LGG重构肠道微生物群

为了确定LGG如何调节肠道炎症反应和肠道通透性，作者研究LGG对肠道微生物群的影响。首先评估肠道微生物生态系统的整体多样性和结构。16S rDNA测序对小鼠粪便检测结果显示，具有97％同一性的529个OTU可用于评估各组之间的差异，LGG+TDF 和 ZOL+TDF的细菌多样性和丰富度均显着降低。此外也揭示了LGG + TDF组的菌群结构与TDF组不相似。作者发现了不同实验组各自的优势菌群，其中值得注意的是，在LGG + TDF组高度丰富的物种中，乳球菌与Candidatus-Arthromitus菌群表现出高度的正相关。

图7 | LGG在8周重建了肠道微生物系统

5.LGG改变肠道微生物代谢产物

作者使用基于LC-MS非靶标代谢组学方法寻找LGG + TDF和TDF组之间的差异代谢物。OPLS-DA模型表明LGG + TDF和TDF组之间区分明显，并从16,981个峰中找到了116个差异较大的代谢物（VIP >1.0）。基于相对丰度倍数变化（FC>2.5或<0.4），又从中筛选出19个显著差异的代谢物（表2），其中有8种甘油磷脂。在LGG + TDF组的粪便样本中有就六种甘油磷脂，并且其中两种在TDF组也能找到。基于KEGG数据库及代谢通路富集发现，LGG + TDF组的甘油磷脂代谢与TDF组相比增加（p <0.01）。此外在LGG + TDF组的六个甘油磷脂中有四个溶血磷脂酰胆碱（LysoPCs），它们可能通过抑制白细胞浸润、白三烯和促炎细胞因子而具有抗炎能力。值得特别注意的是，代谢产物N-乙酰基-白三烯E4在TDF组相对含量最高，它与许多病理生理学特征（包括炎症、哮喘和血栓形成）呈显著正相关。

表2 LGG+TDF和TDF两组间的19个差异代谢产物

小结：

①与仅服用TDF组相比，口服LGG可使骨小梁微结构、皮质骨量和生物力学性能显著增加。

②LGG治疗增加肠屏障完整性，扩增了调节性T细胞，减少了Th17细胞，并且下调了骨髓、脾和肠中破骨细胞生成相关的细胞因子。

③LGG重建肠道微生物群结构并改变代谢物组成，尤其是溶血磷脂酰胆碱水平。然而在TDF组N-乙酰基-白三烯E4的量最高。

实验结论

LGG重建了肠道微生物群的群落结构，促进了溶血磷脂酰胆碱的表达，并改善了肠道完整性，从而抑制了TDF诱导的炎症反应，导致TDF诱导的小鼠骨丢失减弱。LGG益生菌可能是预防和治疗TDF诱导的骨质疏松症的安全有效的策略。

图8 | LGG减弱TDF诱导的骨质丢失机制的示意图

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本文旨在探索益生菌（LGG）改善骨质疏松症的作用机制。首先使用多种临床以及生理检测手段，对构建的5种小鼠模型进行检测，发现服用LGG确实可改善TDF引起的骨质流失，而且从临床角度观察到相关症状的改变。这些检测也从生理表型进一步确认实验模型的差异。为了进一步研究其作用机理，作者对LGG+TDF和TDF组进行了16S rDNA测序和代谢组研究，发现服用LGG可重构肠道微生物群、改变代谢物组成，并解释了相关机理。本文基于严谨的实验设计、临床和理化试验及多组学联合分析（基因测序+代谢组）的整体研究思路，十分值得借鉴。

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