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【多层组学】客户文章 |汕头大学医学院对急性心肌缺血（AMI）诱导的致死性心室快速心律失常（LVTA）的潜在生物标志物研究

2020.3.30

心源性猝死（SCD）是指在症状出现后不到一小时内突然发生的意外死亡。SCD每年影响大约300万人。我国SCD死亡率为0.418%。在美国和英国，SCD每年分别造成约300000人和60000人死亡。缺血性心脏病（IHDs）是SCD的主要病理基础，致死性室性心动过速（lvta，特别是室性心动过速和室颤）是SCD最常见的电生理事件。重要的是，LVTA在其他条件（如心肌离子通道疾病）引起的SCD中很常见。因此，阐明LVTA本身的病理生理过程，将有望为LVTA和SCD的防治提供指标。

前言

本文由鹿明生物合作客户汕头大学医学院法医学系王典团队在 Journal of Proteomics 发表的 “急性心肌缺血（AMI）诱导的致死性心室快速心律失常（LVTA）的心肌脂质组学和蛋白质组学综合分析暗示线粒体功能障碍”的文章，通过LC-MS脂质代谢分析和蛋白质组iTRAQ定量分析，构建了蛋白质和脂质相互作用网络，发现和评估了一些潜在的脂质生物标志物。

英文标题：Integrative analyses of myocardial lipidome and proteome implicate mitochondrial dysfunction in lethal ventricular tachyarrhythmia (LVTA) induced by acute myocardial ischemia (AMI)

中文标题：急性心肌缺血（AMI）诱导的致死性心室快速心律失常（LVTA）的心肌脂质组学和蛋白质组学综合分析暗示线粒体功能障碍

材料：大鼠心肌

影响因子：3.537

发表期刊：Journal of Proteomics

发表日期：2019年3月

主要运用鹿明生物技术：脂质非靶标代谢组、iTRAQ定量蛋白质组学

研究背景

致死性心室快速心律失常（LVTA）是导致心源性猝死（SCD）最普遍的电生理事件，因此阐明LVTA病理生理过程很有意义，并且有望为SCD的预防和治疗提供方向。作者研究了由心肌缺血（AMI）和心肌离子通道疾病（MICD）诱发的LVTA中常见的脂质组分布，还揭示了心肌离子通道疾病诱发的LVTA-SCD后血清脂质组的实质性变化，已发现脂质代谢紊乱与心律不齐有关。这些结果表明，脂质代谢可能在室性心律不齐的病理生理过程中，特别是在致命性快速性心律不齐中起重要作用。因此在这项研究中，作者分析了由于急性心肌缺血（AMI）而经历LVTA的大鼠的心肌脂质组和蛋白质组，比较了实验大鼠心肌的脂质组学和蛋白质组学特征。在差异表达蛋白和脂质组差异的基础上，进行GO分析和代谢途径富集分析，构建了相互作用网络和脂质途径网络。此外还评估了关键差异脂质的诊断价值，以筛选潜在的脂质生物标志物。

研究策略

研究方法

1. 实验分组

8-10周大鼠冠状动脉结扎（CAL）引发AMI用于产生CAL-T和CAL-N组。致死性室性心动过速（LVTA）死亡的大鼠定义为CAL-T组，在结扎后30分钟内死于心动过缓的大鼠定义为对照组（CAL-N）。死亡后立即取回心脏，并将其储存在-80℃待进一步分析。12只CAL-T大鼠和12只CAL-N大鼠用于脂质组学分析，随机选择其中6只进行蛋白质组学分析。

2.检测方法

（1）心肌氯化三苯四唑（TTC）染色；

（2）LC-MS脂质组学分析；

（3）iRATQ蛋白质组定量分析；

实验结果

1.待测大鼠的ECG和TTC染色特征

所有实验大鼠均显示左冠状动脉结扎后心电图ST段升高。在结扎后4-10分钟内，所有CAL-T大鼠均出现典型的VT和VF（图1 A）。同时，TTC染色显示受试者心肌左心室前壁和心尖的区域较浅（图1 B）。ECG和TTC染色结果均证明了AMI的发生。

图1 | 心电图（ECG）（A）和三苯基四唑氯化物（TTC）染色（B）

浅色区域和红色区域分别表示缺血区域和非缺血区域。CAL-pre：结扎前；缺血：结扎后立即发生AMI；CAL后：AMI后发生LVTA或心动过缓

对于选择进行脂质组学分析和蛋白质组学分析的六只CAL-T大鼠，VT和VF的总持续时间为187 至342秒，心律不齐评分的范围为6至7（表1），证实发生LVTA。

表1 | 测试老鼠的心电图参数

2.CAL-T和CAL-N组之间的脂质组的差异

通过脂质组学分析PLS-DA模型显示CAL-T组和CAL-N组之间有清晰的分离，表明它们之间的脂质分布不同。共筛选了257种差异脂类，包括15种脂类（心肌磷脂CL、神经酰胺Cer、二酰基甘油DG、三酰基甘油TG、磷脂酰PE、磷脂酰胆碱PC、溶血磷脂酰LPE、溶血磷脂酰胆碱LPC、磷脂酰丝氨酸PS、溶血磷脂酰丝氨酸LPS、鞘氨醇SO、鞘磷脂SM、磷脂酰肌醇PI和磷脂酰甘油）。经过LVTA的大鼠心肌中，Cer、CL、LPC、LPE、LPS、PC、PE和PG被下调，而DG和SO被上调。

3.CAL-T和CAL-N组之间的蛋白质组差异

通过iTRAQ蛋白质组定量分析在心肌中共鉴定出2005种蛋白质（FDR <1％），其中有表达差异的蛋白质814种。使用更严格标准（FC>2.5或<0.4，且p <0.01）来筛选关键的差异表达蛋白，其中209个蛋白被上调，而226个蛋白被下调（图2）。

图2 | 表达有差异的蛋白质（A）和脂质（B）的热图

从绿色到红色代表CAL-T中蛋白质或脂质与CAL-N的相对含量

对这些关键蛋白的基因本体论（GO）富集分析表明，线粒体及其膜是主要相关的细胞成分（Mp68、Park7、Akap1和Mtco2）；电子传输链、氧化磷酸化、ATP合成耦合电子传输和NADH脱氢酶活性（Ugp2、Nnt、Acadvl、Ndufs7、Mt-Cyb、Mtco2、Mtnd4l、Cox6a1、Mtnd4l、Ndufb1、Mtnd5和Ndufa9D、Sdhb和Idh1）和氧化磷酸化（Ndufs1-4、ISP、SDHB、COX5A、OSCP等）是LVTA过程涉及的主要分子功能和途径（图3）。这些结果提示LVTA过程中线粒体呼吸链功能异常。

图3 | 差异表达蛋白质的基因本体分析（GO）和途径富集分析

A.GO富集直方图；

B/C KEGG途径富集；

红色填充框和绿色填充框分别代表相应的蛋白质被上调和下调

4.差异表达的脂质和蛋白质的相互作用网络

为了探索差异脂质与差异表达蛋白之间的相互作用，基于关键差异脂质（前10％Pearson系数相关性），作者使用Cytoscape软件构建了一个交互式网络（p <0.05，VIP> 1和FC> 1.5或<0.67）和关键差异表达蛋白（p <0.01，FC> 4或<0.25）。如图4所示大多数关键差异表达蛋白高度相关，并且也与关键差异脂类物质呈负相关，表明这些脂质和蛋白在LVTA过程中紧密相互作用。

图4 | 有差异的关键脂质和蛋白质的相关网络

绿线表示负相关，浅红线表示正相关（基于系数相关性的前10％）

此外作者分析了心电图参数（VF，VT + VF和心律失常评分）与脂质相对量之间的皮尔逊相关性。结果有15种脂质与至少一项ECG参数呈中等程度的负相关（| r |> 0.4和p <0.05，表2），表明这些紊乱的脂质参与了LVTA的病理生理机制。

表2 |有差异的关键脂质与心电图参数之间的相关性

5.与LVTA相关的脂质通路网络

为了初步探讨LVTA的脂质相关病理生理过程，基于差异性脂质的类别，作者构建了一个脂质通路网络。首先利用LIPID MAPS现有脂质途径，计算脂质反应的Z值评估某种脂质反应的活性状态，最后将差异表达的蛋白质整合到途径中以支持Z分数所指示的结果。Z值显示在LVTA过程中有7个脂质反应活跃（得分大于1.645），包括DG→PE、PE→LPE、PA→DG、PC→DG、PE→PA、Cer→SM和LPE→LPC。蛋白质组学结果部分证实了LPE→PE的激活（图5）。

图5 | 脂质途径网络

A.两组不同类别脂质相对丰度的直方图；

B.脂质途径网络

在线上的蛋白质是相应反应的酶，其中红线和绿线分别代表上调和下调的蛋白质；线上的数字是z分数；红线表示反应产物大于反应物，而绿线表示含义相反（z值标记为负）

6.AMI诱导LVTA的潜在脂质生物标志物

首先通过严格的统计标准（即VIP>1，p<0.05，AUC>0.9，FC>1.5或<0.67，以及与ECG参数的相关性）筛选潜在的AMI诱导的LVTA脂质生物标志物，共筛选出15种脂质。然后使用MDR进行层次聚类分析（HCA）（图6A）。最后选择了三种脂质，每种脂质代表一个大族，且与LVTA的病理生理机制密切相关，包括CL（72：7），PE（42：4）和LPE（P-18：0），选择这些脂质作为潜在的脂质生物标记。经过种测试后，这三种生物标志物的平均AUC值分别为0.956、0.934和0.930，标准偏差（SD）分别为0.067、0.013和0.015，表明这些生物标记物具有可靠的诊断价值。此外作者通过二元逻辑回归分析结合这些标记物，以检查其总的诊断潜力。ROC曲线显示，它们共同的AUC为0.98、特异性为100％、对诊断AMI诱导的LVTA的敏感性为91.7％（图6B）。

图6 | AMI诱导LVTA的潜在生物标志物

A.15种脂质物种的层次聚类分析（HCA）；

B.三种脂质及其组合的受体的操作特性曲线（ROC曲线）

相关讨论

ECG性能和参数以及TTC染色证实了LVTA大鼠中AMI和LVTA的发生（图1和表1）。对照组接受了相同的手术程序，并经历了急性心肌梗死。因此麻醉手术和AMI的影响得到了很好的控制。此外两组均来自同一动物，性别相同，体重相似。因此本研究报道的心肌代谢过程的差异很可能是LVTA的结果。

热图和PLS-DA图表明心肌脂质组受到AMI诱导LVTA的极大干扰（图2）。在总共257个脂质物质（15个脂类）确认了151个关键差异脂质物质。在LVTA组中，大多数差异脂质下调，与作者先前研究的结果相比，在经历了AMI诱导LVTA的大鼠与遭受MICD诱导LVTA的大鼠之间的心肌中发现了常见的脂类，但脂质差异更大（AMI特异性vs.普通），同时发现了活化的脂质反应（MI特异性与常见，7相对于4），表明LVTA的脂蛋白范围广泛，与AMI相关。在两项研究中差异脂质的变化趋势基本一致。此外两项研究均发现有两种脂质反应途径活跃，即LPE→LPC和DG→PA。

结果显示，LVTA期间257种脂质和814种心肌蛋白被破坏。心肌磷脂（CL）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰（PE）、神经酰胺（Cer）、溶血磷脂酰（LPE）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、磷脂酰甘油（PG）和溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）下调；而鞘氨醇（SO）和二酰基甘油（DG）上调。这些蛋白质的富集分析表明线粒体功能障碍。大多数差异脂质显示出与核心差异表达蛋白的高度相互作用。在此过程中，包括DG→PE、PE→LPE、PA→DG、PC→DG、PE→PA、Cer→SM和LPE→LPC的七个脂质途径活跃。LPE→PE的激活可以通过蛋白质组学结果确认部分。CL（72：7）、PE（42：4）和LPE（P-18：0）共同代表了潜在的LVTA诊断标记。总之作者发现LVTA大鼠心肌中脂质组和蛋白质组明显紊乱，主要涉及线粒体呼吸链功能障碍。

值得注意的是在AMI诱导LVTA过程中，有十种脂质被下调。在这些脂质中，PC、PE、PG和CL膜的组成成分。这些膜脂质类别的减少或组成比变化可能会改变膜的流动性，并影响通过特定通道的离子通量（例如，Na +、Ca2+，K +），两种作用都能够诱发致命性心律失常或加重现有的心律失常，成为LVTA。此外作者先前在LVTA中进行的心肌代谢研究发现四种游离脂肪酸的表达下调，它们代表了心肌的主要能量来源。因此脂质代谢紊乱可能伴有能量代谢紊乱，并对AMI后致死性心律失常有较高敏感性。

大约10％的差异脂质为心肌磷脂（CL），在经历LVTA的大鼠中总含量下降。最近的研究表明CL在超复合物中线粒体ETC的高级组织中起着核心作用，并且CL对于呼吸超复合物的形成或稳定必不可少。因此在LVTA大鼠心肌中观察到的CL水平降低可能与过程中线粒体呼吸超复合物的功能障碍有关。PE在线粒体中含量丰富，并参与哺乳动物细胞（包括呼吸链）的多种细胞功能。作者发现CAL-T大鼠心肌中的PE水平降低，这可能是由于LVTA中的氧化应激引起的脂质过度氧化。先前的研究表明，PE是呼吸链中复合物IV的几个组成部分的重要组成部分，在哺乳动物中，线粒体PE的耗竭可能会破坏与复合物IV相关的更高阶复合物的形成。此外沉默线粒体中PE的合成可降低呼吸链中复合物I和复合物IV的活性，从而抑制氧的消耗和ATP的产生。因此心肌中PE的下调可能与LVTA过程中呼吸链功能的破坏有关。

蛋白质组学结果显示，心肌蛋白组在AMI诱导LVTA后受到干扰（图2）。作者发现被干扰的蛋白质富含电子传输链，ATP合成耦合电子传输、NADH脱氢酶活性、柠檬酸盐循环和氧化磷酸化，暗示这些功能在LVTA中受到干扰（图3）。此外途径富集表明复合物I，II和IV的活性在LVTA期间被下调（图3），反映了在这种LVTA条件下电子传输链活性的崩溃和离子浓度梯度的分散。而复合物III和V的活性被上调（图3），这表明在LVTA过程中，活性氧的含量增加，对ATP的需求也很大。先前的一些研究已经证实心律不齐与线粒体功能障碍之间的相关性。另外作者通过代谢组学发现AMI和MICD诱导的LVTA中三羧酸（TCA）循环受到抑制。因此在AMI诱发的LVTA过程中，脂质组和蛋白质组的结果以及代谢组均与线粒体呼吸链功能障碍有关。

根据上述研究结果，作者选择CL（72：7），PE（42：4）和LPE（P-18：0）作为LVTA的潜在脂质生物标记物。它们的脂肪酸支链分别是（18：2/18：1/18：2/18：2），（22：0/20：4）和（18：0p）。从理论上讲，这些脂质可能与AMI引起的LVTA的病理生理过程有关，主要与线粒体呼吸链功能障碍有关。这些脂质与ECG参数呈中等程度的负相关。同时它们的脂肪酸链大部分是长链脂肪酸，含有至少18个碳，适于能源供应。因此作者推测，LVTA过程中心律失常的严重程度与线粒体呼吸链的结构和功能损伤程度有关，这种损害可能增加脂质成分的分解。

实验结论

在这项研究中，作者结合了脂质组学和蛋白质组学分析，调查AMI诱发LVTA的病理生理过程，描述了LVTA在心肌中的整体脂质和蛋白质特征。通过建立的计算方法评估所鉴定的脂质途径的活性，蛋白质组学证实了部分结果。脂质组学和蛋白质组学结果均显示线粒体功能障碍，特别是呼吸链相关功能障碍，与LVTA的病理生理有关。目前的研究表明，脂质组学和蛋白质组学的综合分析可以描述LVTA的病理生理过程，并可能有助于鉴定脂质生物标志物，将成为进一步研究的目标。但是当前结果所隐含的病理生理过程需要使用其他技术进行验证。由于提示线粒体功能障碍，LVTA期间的线粒体脂质组学，蛋白质组学和代谢特征需要在以后的研究中阐明。

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本文使用了脂质组学和iTRAQ定量技术进行综合分析，比较全面地阐述了致死性心室快速心律失常（LVTA）的生物学机制，发现该症状与线粒体功能障碍、特别是呼吸链相关功能障碍的关系，并筛选出3个潜在标志物。文章研究思路清晰，是一篇很好的多组学联合分析研究范例。

部分文献参考

[1] A.S. Adabag, et al., Sudden cardiac death: epidemiology and risk factors, Nat Rev Cardiol 7 (4) (2010) 216–225.

[2] L.M. Douglas, et al., Cardiac arrest and sudden crdiac death, in: M. Eugene Braunwald, MD(Hon), ScD(Hon), FRCP (Ed.), Braunwald's Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine, Saunders, Philadelphia, 2015, pp. 821–860.

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