单细胞测序改写药物发现研究范式，带来革命性创新

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单细胞测序改写药物发现研究范式，带来革命性创新

2020.1.17

导读

文章题目：Massively multiplex chemical transcriptomics at single-cell resolution

常规高通量化合物筛选过程中（High-throughput chemical screens），采用的指标比较粗放，无法揭示深层的分子机制，例如脱靶效应（off-target effects）、药物起效机制（mechanisms of action）等……

本文中，作者开发了一种基于高通量单细胞测序的筛选技术——sci-Plex，结合nuclear hashing以及sci-RNA-seq技术，可在单次实验中完成数千种处理条件下单细胞转录组的鉴定与药物筛选。为了进行概念验证，作者对三个不同癌症细胞系分别使用188种化合物处理后的单细胞转录组进行了分析，在单次实验中完成了共计约5000种不同处理条件下65万个单细胞转录组的解析。通过这种“单细胞分辨率”的分析，作者发现众多由于细胞异质性造成的对特定化合物响应的转录差异，同时也鉴定到众多同类化合物所激发的共性反应。更进一步的，作者聚焦于HDAC抑制剂引起的转录反应，证实染色质是癌细胞重要的乙酸盐贮存库。sci-Plex技术以前所未见的分辨率和通量，为药物筛选带来了革命性的改变。

传统高通量筛选的缺陷

高通量筛选（High-throughput screens，HTS）是现代药物发现的基础。传统的HTS存在两个主要缺点：

1、筛选指标往往限制于一些粗略的表型，如细胞形态、细胞增殖等，无法发现深层的分子机制。

2、使用高通量测序手段，以molecular phenotyping的方式进行筛选时，bulk analysis无法反映出由于细胞异质性造成的对药物响应的差异，也限制了筛选的效果，因为细胞的异质性往往与化疗效果高度相关。例如，2017年一项针对黑色素瘤（Melanoma）的研究中[1]，作者通过单分子RNA荧光原位杂交技术（Single-molecule RNA FISH），发现在相同类型的癌细胞中，其抗药性基因的表达量存在显著差异（图1），在整个细胞群体中，存在微量的抗药基因高表达的单个细胞。这些细胞对化疗具有较高的耐受力，会对特定药物产生抗性，从而在人为的选择压力下大量增殖，造成临床上出现抗药性。然而，目前的HTS手段无法对这些异质细胞进行鉴定与分析，因此，其抗药性产生的深层次的分子机制仍然未知。

单细胞测序为药物开发带来新机遇

单细胞测序技术为解决以上问题带来了革命性的机遇。本文中，作者仿效cellular hashing，通过单链DNA分子标记同一处理条件下的细胞核，开发了nuclear hashing技术。在此基础上，结合本实验室的sci-RNA-seq技术[2]（single-cell combinatorial-indexing RNA-sequencing）开发了sci-Plex（图2）。在概念验证实验中，作者使用188种化合物对三个肿瘤细胞系进行处理，不同时间点、不同药物的组合共计约5000种处理条件，通过sci-Plex对65万个单细胞转录组进行了分析，从而以“单细胞分辨率”揭示了不同肿瘤细胞对不同药物响应的深层次分子生物学机制。

cellular hashing是一种细胞标记技术，其名称借鉴于计算机科学中的哈希函数（hash functions）[3]，因为哈希函数是一种为数据集建立分类索引的方法。传统cellular hashing是通过特定抗体偶联DNA序列来标记细胞：同一种抗体能够识别具有相同表面抗原的细胞，因而将“这一类”细胞标记上相同的DNA序列。通过这种方式，偶联的DNA序列在后续测序分析中可对含有不同表面抗原的细胞进行区分，从而达到细胞分类的目的。但cellular hashing技术需要制备偶联DNA的特定抗体，因此成本高昂，并不适用于HTS的流程。另外，sci-RNA-seq技术虽然可以对不同处理条件的样本进行标记，但连接反应所用的酶等试剂价格较高，若需要对数千种不同的处理条件进行标记，其成本也难以接受，因而限制了其应用于HTS的能力。本文中，作者改进了cellular hashing的方法，通过单链DNA对不同处理条件的细胞核进行标记，命名为nuclear hashing。其原理基于一项简单的发现：单链DNA能够扩散进入固定后的细胞核。因此，作者通过带有一段barcode序列的polyA单链DNA，对来源于同一处理条件的细胞核进行标记。在随后的sci-RNA-seq流程中，来源于同一处理条件的hashing序列被扩增，从而完成了不同处理条件的标记与区分。

sci-Plex相比传统HTS的优势

1、sci-Plex能够以较低的成本实现单细胞测序。nuclear hashing相对cellular hashing能够同时标记大量的不同样本，极大的节省了测序成本。sci-RNA-seq是基于细胞组合标签（cell combinatorial indexing）发展起来的单细胞转录组测序技术[4][5]，目前可将单细胞测序的建库成本控制在单个细胞0.01美元以下[2]，且单个实验中细胞总量可以达到百万级别。

2、单细胞测序为新药研发带来全新的视角与见解，能够揭示传统技术无法发现的分子机制。nuclear hashing及sci-RNA-seq这两种技术结合产生的sci-Plex技术相比传统HTS具有前所未见的单细胞分辨率。基于此，sci-Plex能够识别出同样处理条件下，不同的细胞亚型对药物响应的差异，同时能够通过拟时序分析等手段，勾画出在特定化合物处理条件下，细胞转录组的变化轨迹（trajectory）。对HDAC抑制剂的进一步分析证实了sci-Plex技术的这些优势：数据不仅能够反映出由于细胞异质性造成的对HDAC抑制剂响应的差别，同时能够鉴定到与HDAC抑制剂起效相关的特征基因，从而发掘出这些化合物作用的分子机制，而这些机制是通过传统HTS手段无法发现的，例如文中提出的新的HDAC抑制剂作用模型。

综上所述，sci-Plex技术以较合理的成本、单细胞分辨率、超高通量的方式为新药发现相关研究提供了革命性的工具，未来具有广阔的应用前景。

图1 | AXL等抗药基因表达量的计算机模拟图

通过单分子RNA荧光原位杂交，对相同类型的癌细胞中几种抗药基因的表达量进行鉴定。图中可见AXL基因的表达量在单个不同细胞间存在明显的差异，且存在微量的AXL高表达的细胞。图中每一个亮点代表一个细胞，颜色差异代表相应基因的表达量差异。

图2 | Sci-Plex技术流程图示

三种癌症细胞系通过不同化合物进行处理。而后将细胞裂解，收集细胞核。每一种处理条件下使用特定的单链DNA进行标记（nuclear hashing），以便在后续分析中区分不同的处理条件。所有细胞随后进行混匀并通过sci-RNA-seq技术对单细胞进行标记，然后进行单细胞测序。

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参考文献

[1] Shaffer SM et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 2017 Jun 15;546(7658):431-435.

[2] Cao J et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis.Nature. 2019 Feb;566(7745):496-502.

[3] Stoeckius M et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology 2018 19:224.

[4] Cusanovich, D. A. et al. Multiplex single cell profling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing. Science 2015 348, 910–914.

[5] Cao, J. et al. Comprehensive single-cell transcriptional profling of a multicellular organism.Science 2017 357, 661–667.

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