电镜技术 | 让新冠病毒一览无余

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电镜技术 | 让新冠病毒一览无余

2021.8.10

2020年，对所有人来说都是不平凡的一年。新冠肺炎疫情（COVID-19）突如其来，改变了所有人的生活，截至2021年6月16日北京时间15:01，全球累计确诊已达1.77亿之多，累计死亡382万多人。

一颗小小的冠状病毒，竟让整个世界为之改变。它长什么样？在整个疫情的防控防治过程中，正是电镜技术，让病毒一览无余。
负染色技术在第一时刻揭示了病毒的大概形貌，明确2020年这波疫情是由冠状病毒引起；紧接着在清华大学李赛老师带领下，冷冻电镜断层成像及子断层图像平均重构技术从内到外地揭示了真实新型冠状病毒的全病毒三维结构。分辨率达7.8-11Å的高清结构，对疫苗及抗体研发、疫情防控宣传、科普教育、分子动力学模拟等都起到了重要作用。

负染色技术—鉴定病毒形态

为什么是冠状病毒？

电镜给了一个很重要的指标：病毒形态。

2020年1月6日，中国疾控中心通过对临床患者分离毒株样品进行电镜负染色，发现了病毒的存在，且形状与冠状病毒相似，直径80-120nm，表面有皇冠一样的突起，这就给我们一个很重要的方向指示。随后，根据核酸序列比对以及其他鉴定方法，宣布新型冠状病毒肺炎疫情爆发。

我国第一株新冠病毒毒种信息电镜负染照片

负染色技术可以鉴别病毒形态、纯度和浓度。负染技术流程简单，检测速度快。一般几分钟就可以完成。

载网要求：

1.载网亲水：商业化载网表面有油脂，悬液样品铺不开

载网辉光放电处理后，亲水性增强，悬液均匀铺开

2.碳膜载网：促进样品颗粒均匀分布

徕卡高真空镀膜仪，一机两用：镀膜+辉光放电

EM ACE系列镀膜仪

负染技术—徕卡解决方案

冷冻电镜技术—指导药物和疫苗设计

清华大学生命学院李赛研究员课题组和浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室李兰娟院士课题组紧密合作，利用冷冻电镜断层成像和子断层平均重构技术成功解析了新冠病毒（SARS-CoV-2）全病毒三维结构，这一重要研究成果于北京时间2020年9月15日以 “新冠病毒的全分子结构”（Molecular architecture of the SARS-CoV-2 virus）为题在国际权威学术期刊《细胞》杂志上在线发表。

首次解析新冠全病毒分子结构
这项研究首次解析了新冠病毒全病毒的高分辨率分子结构，使世界对新冠病毒的认识更近一步，为抗击疫情、治疗新冠肺炎打下坚实全面的结构基础。在这项研究中，浙大团队提供了经严格灭活、含有新冠病毒的细胞培养液，保证了样品的天然结构。
清华团队在二级实验室提纯浓缩病毒后，使用实验室开发的高通量、高分辨冷冻电镜断层成像技术（cryo-ET），采集了100TB数据、筛选出2294颗病毒颗粒（目前已知的关于新冠病毒最大的cryo-ET数据集），并重构出一颗具有代表性的完整的病毒三维结构，分辨率达7.8-11Å。统计结果表明，新冠病毒囊膜平均直径约80纳米，表面约有30个刺突蛋白，内部约有30个核糖核蛋白复合物。

新冠病毒结构及冷冻电镜断层图像

原位状态下深度分析刺突蛋白结构
新冠病毒的“皇冠”特征，来源于它表面的刺突蛋白，凸起于病毒表面，是其侵入人体细胞的“钥匙”，目前大多数疫苗和抗体的研发均聚焦于该蛋白。
该研究解析出处于融合前状态及融合后状态的三种不同构象刺突蛋白结构。结果表明，刺突蛋白在病毒表面呈随机分布，且可自由摆动，类似于古代武器“链锤”，这种灵活的特性有利于“钥匙”及时调整方向，同细胞上更多的“锁”（受体）结合而增加侵染细胞几率。刺突蛋白也很脆弱，灭活和提纯方式不当可能导致其部分、甚至完全脱落，产生不正常的“秃”病毒。
刺突蛋白表面有多达66个糖基化修饰，这些糖像盾牌一样保护病毒不被免疫识别。此前未有对病毒上天然状态下糖基化修饰的详细研究。在清华大学蛋白质化学与组学平台的帮助下，该问题得到详细解答：相比于重组刺突蛋白，原位的糖基更大也更复杂，但总体而言相似性较大，这种相似性保证了重组刺突蛋白研发疫苗工作的有效性。

全球首次从内到外完整揭示新冠病毒全病毒精细结构

开创性揭示核糖核蛋白复合物天然结构
新冠病毒的所有遗传信息都编码在其核糖核酸（RNA）上。病毒想要“繁衍”下一代，就必须保护好这根“生命之源”。冠状病毒的RNA是所有已知RNA病毒中最长的，其直线长度可达自身直径的100倍。如何把这根核酸“长绳”完整有序地缠绕进仅有数十纳米直径的体内，是所有病毒都要费劲儿解决的几何难题。这个重任主要落在核蛋白上，它像线轴一样收纳RNA，将其有序缠绕，并组装成称为核糖核蛋白复合物（RNP）的高级结构，才能将RNA完整塞进体内。在病毒发生膜融合及去组装后，它又能有条不紊的释放RNA。这个包装方法及过程，不仅对于新冠病毒是个未解之谜，甚至在所有正义单链RNA病毒中也是几何谜题。
李赛课题组对病毒内近30000颗RNP进行了挑选和分析，开创性地展示了病毒腔内核糖核蛋白复合物结构及组装机制。该复合物像串珠一样将RNA组织在一起，并在病毒体内呈现六聚“鸟巢”型和正四面体“金字塔”型两种局部排列，有序地收纳了RNA这根“长绳”，还增加了病毒在复杂环境中经受物理挑战的能力。这是世界范围内首次“看清”正义单链RNA病毒的内部结构。
这一真实的病毒三维图像让“看不见的敌人”清晰地展现在世人面前，首次让世界看到新冠病毒全病毒结构。这一成果对疫苗及抗体研发、疫情防控宣传、科普教育等均有重要意义。其中一位审稿人在评审意见里称赞道：“这项工作展示了迄今为止我所见过的最完整新冠病毒形象，这也是使用冷冻电镜断层成像方法解析完整颗粒结构的一次绝妙的应用……”。法国科学院院士、著名结构病毒学家Felix A.Rey教授来信祝贺道：“这是一个里程碑式的工作”。

冷冻电镜制样技术路线

技术流程与负染类似，但是样品最终要经过投入冷冻固定，在低温电镜下进行观察。

徕卡EM GP2，就是一款专业的投入冷冻仪，通过对样品的单边或双边的平行吸附，实现样品的快速均匀冷冻。包括生物样品，工业溶剂、悬浊液、乳浊液、胶体样品等。

冷冻电镜技术—徕卡解决方案

近年来先后暴发的病毒疫情：如埃博拉出血热、冠状病毒感染引起的严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和新型冠状病毒肺炎以及寨卡病毒病等，严重威胁了人民生命健康和社会公共卫生安全。因此，针对尚未表征的新发病原体，尤其是针对变异速度快、宿主范围广、传播能力强的病毒病原体采取有效的防控策略尤为重要。