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单细胞测序助力解析转录因子c-Maf介导细胞代谢调控γδ T17细胞发挥效应功能的作用机制
前言
Science子刊来了！近日，上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科陈福祥教授团队与美国路易斯维尔大学医学院免疫、肿瘤与生物医学中心严俊教授合作在Science Advances（IF:14.136）发表转录因子c-Maf通过调节代谢途径调控γδ T17细胞发挥效应功能的相关成果。陈旭博士为该文章的第一作者，欧易生物提供了该项目单细胞转录组测序相关工作。
材料：2例OSCC肿瘤组织；2例癌旁
期刊：Science Advances
发表时间：2022年5月
方法：欧易生物10× Genomics scRNA-seq
研究背景和研究目的
γδ T 在维持小鼠和人组织稳态以及宿主病原体防御方面发挥关键作用，根据分泌的细胞因子不同，γδ T 细胞主要可以分为分泌IL-17的γδ T17细胞和分泌IFN-γ的γδ T1细胞，γδ T17在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤微环境中具有促炎功能。有研究报道，在小鼠中转录因子c-Maf对于γδ T17细胞的生成必不可少。然而，c-Maf在人γδ T17细胞生成中的作用及其在人类疾病中的潜在作用尚不清楚。此外，研究者发现γδ T1和γδ T17具有不同的代谢途径，而代谢又与转录因子介导的分子信号一起协调细胞发挥相应功能，但是转录因子介导的细胞代谢复杂网络如何针对γδ T 细胞进行调节目前尚不清楚。因此，这篇文章主要探究c-Maf在γδ T17代谢调节中的具体作用机制，以期为γδ T17定向分化的机制提供新的线索。
内容概述
作者首先研究了CD27 γδ T1与CD27 γδ T17细胞之间的代谢差异，接着针对性抑制代谢通路证明它们对于两种细胞效应功能的影响。作者进一步探究代谢通路中的系列限制酶对两类γδ T分泌细胞因子的影响，找到CD27和CD27 γδ T 细胞的代谢检查点——IDH2，更进一步发现转录因子c-Maf调节IDH2活性，且通过构建敲除c-Maf小鼠模型验证该转录因子的重要性。除此之外，作者针对OSCC患者癌和癌旁组织进行单细胞测序，结果表明c-Maf在人类疾病中通过调控γδ T17代谢重编程发挥相应效应功能。
研究背景和研究目的
1.CD27 γδ T 细胞与CD27 γδ T 细胞代谢差异
T细胞效应功能差异与特殊代谢途径相关。CD27是区分分泌IFN-γ的γδ T 细胞(CD27γδ T1)与分泌IL-17的γδ T 细胞(CD27 γδ T17)的功能标记物。因此，作者接下来利用CD27作为分子标记物探究CD27 γδ T1与CD27 γδ T17之间的代谢差异。首先，作者发现，相比于CD27 γδ T17，CD27 γδ T1高表达葡萄糖转运蛋白1 (glucose transporter 1, Glut1)，通过2-NBDG示踪发现CD27 γδ T1中葡萄糖摄取量也更高 (图1, A and B)，表明CD27 γδ T1主要利用糖酵解代谢途径。相反，CD27 γδ T17更高表达谷氨酸代谢相关代谢酶，例如谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)和谷氨酸脱氢酶1(glutamate dehydrogenase 1, GLUD1) (图1C)，说明CD27 γδ T17可能依赖谷氨酰胺水解代谢途径以发挥效应功能。之前的研究表明，γδ T17主要利用氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)途径，提示三羧酸(TCA)循环在γδ T17细胞中的重要性。
为了进一步分析γδ
T 细胞的代谢途径，作者利用C标记的葡萄糖进行稳定同位素分析代谢组学(stable isotope-resolved
metabolomics, SIRM)分析 (图1D)。分析结果显示，CD27 γδ
T1中丙酮酸和乳酸等同位素标记物增加，揭示其以糖酵解为主要代谢途径 (图1D)，而在CD27 γδ
T17中，同位素标记物如顺式乌头酸、α-酮戊二酸、苹果酸和谷氨酸等主要参与TCA循环(图1D)，该结果进一步说明CD27γδ T1与CD27
γδ T17之间的代谢途径存在差异。
由于OXPHOS发生在线粒体中，作者通过MitoTracker Green/Red染色观察这两种细胞的线粒体，发现两者之间线粒体完整性并无差异 (图1E)，而通过mitoSOX Red染色发现，CD27γδ T1中线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species, mitoROS)表达水平更高 (图1F)，且流式分析表明这种差异并非由细胞大小所致 (图1F)。总之，这些结果表明，CD27 γδ T17和CD27γδ T1之间存在代谢和线粒体功能差异。
图1| CD27和CD27- γδ T 细胞代谢差异
2、CD27 γδ T 细胞与CD27γδ T 细胞效应功能受不同代谢途径的调控
为了进一步验证两种细胞因代谢差异所导致的效应功能差异，作者使用小分子抑制剂阻断不同的代谢通路以检测对分泌细胞因子的影响。CD27 γδ T 细胞主要分泌IL-17，而CD27 γδ T 主要分泌IFN-γ (图2A)。2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose, 2-DG)是一种竞争性抑制葡萄糖代谢的葡萄糖类似物，经2-DG处理后，CD27 γδ T17细胞的IL-17分泌水平没有明显改变，而CD27 γδ T1细胞分泌的IFN-γ显著降低，且呈剂量依赖性 (图2B)。
此外，研究发现，通过草酸盐(oxalate,
OXA)靶向抑制丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)，两种细胞因子的分泌均下降，表明这两种细胞存在共同的代谢途径
(图2C)。AGI抑制异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)结果也发现两种细胞中的细胞因子分泌量降低
(图2D)，表明IDH等代谢酶在γδ T 发挥功能中的重要作用。总的来说，CD27 γδ T17细胞与CD27 γδ
T1细胞发挥效应功能依赖于这些差异或者共享的代谢途径。
图2 | 抑制代谢途径影响CD27+和CD27 γδ T 细胞分泌功能性细胞因子
3、IDH2作为γδ T 发挥效应功能的代谢检查点
限速酶在代谢通路中起着关键作用。作者接下来针对参与糖酵解以及TCA循环的一系列限速酶在两种细胞中的表达进行研究，包括己糖激酶1 (hexokinase 1, HK1)、丙酮酸脱氢酶激酶1 (pyruvate dehydrogenase kinase 1, PDK1)、丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2, PKM2)、乳酸脱氢酶A (lactate dehydrogenase A, LDHA)、IDH1和IDH2。PCR和WB结果发现，IDH2在CD27 γδ T17细胞中的表达高于在CD27 γδ T1中的表达 (图3A and B)。C标记示踪实验表明，与CD27 γδ T17细胞相比，CD27γδ T1细胞中异柠檬酸盐向α-KG的转化显著减少，这表明CD27 γδ T1中柠檬酸盐向α-KG的代谢被中断 (图3C and D)。
为了证明IDH2在调节γδ T 效应功能中的作用，使用siRNA沉默CD27 γδ T17中的IDH2，结果发现CD27 γδ T17中的IL-17显著减少 (图3E)。此外，经IDH2 siRNA处理之后，c-Maf和Rorc的mRNA表达水平也显著降低 (图3F)，而在CD27γδ T1中，经过慢病毒转染IDH2处理之后发现，IFN-γ分泌表达下降 (图3G)。作者还发现在培养基中直接添加α-KG同样能够抑制CD27γδ T1中IFN-γ的产生 (图3H)。这些数据表明，IDH2在γδ T 细胞中作为效应功能的代谢检查点。
图3 | IDH2是CD27+和CD27- γδ T 细胞的代谢检查点
4、转录因子c-Maf调节IDH2活性从而调控γδ T 细胞中IL-17的生成
据报道，转录因子c-Maf 在原代CD27 γδ T17及其祖细胞中特异性表达。此处作者利用流式以及PCR验证了c-Maf在CD27 γδ T17中表达，而在CD27γδ T1中不表达(图4A and B)。经过c-Maf特异性抑制剂NIV处理之后，CD27 γδ T17细胞中c-Maf、RORγt和IDH2表达降低，IL-17减少 (图4C)。为了排除c-Maf抑制剂NIV的脱靶效应，作者构建了敲除小鼠Rorc-cre; c-Maff/f，并验证了敲除效果(图4D)。与抑制剂处理结果一致，敲除鼠中IDH2表达显著降低 (图4E)，而GLS和GLUD1的表达水平没有改变 (图4E)。
为了进一步阐明其中的机制，作者使用预测软件针对c-Maf在IDH2启动子区域的结合位点进行筛选，得到两个可能的结合位点，并进一步针对c-Maf进行ChIP检测，分析IDH2启动子活性。结果发现，c-Maf直接结合在IDH2启动子的两个预测区域，而且与之前报道一致，c-Maf也与Rorc启动子区结合 (图4F)。这些数据表明，转录因子c-Maf通过与IDH2启动子区结合直接调控IDH2活性。
图4 | 转录因子c-Maf调节CD27- γδ T 细胞中IDH2的活性
5、γδ T 细胞中c-Maf的缺乏能够减少肺癌的转移
肺中的γδ T17细胞在促进转移性肺癌中发挥关键作用。接下来，作者研究了c-Maf在转移性肺癌发展中的作用。通过尾静脉注射向Rorc-cre; c-Maff/f小鼠及对照小鼠中输注GFP标记的肺癌细胞系LLC。注射14d后，通过流式分析荷瘤情况，发现敲除小鼠中肿瘤细胞LLC明显减少 (图5A)。另外，与对照小鼠相比，敲除小鼠生存周期延长(图5B)。同时，作者针对肺的免疫表型进行检测，发现与对照小鼠相比，敲除鼠肺中γδ T 细胞的占比，尤其是γδ T17细胞的占比显著降低，而产生IFN-γ的γδ T1细胞占比显著升高 (图5C)。然而，CD4和CD8 T细胞中IFN-γ的产生没有差异 (图5D)。
此外，两种小鼠肺部CD45免疫细胞和CD11b髓系细胞的总量占比也没有显著差异 (图5E)。除肺癌外，作者还使用转移性黑色素瘤B16F10模型来验证这一结果，结果也表明Rorc-cre; c-Maf小鼠的存活率延长 (图5F)。这些结果证明γδ T17细胞在转移性肺癌中的关键作用，并提示c-Maf是癌症免疫疗法的潜在治疗靶标。
图5 | 敲除γδ T 细胞中c-Maf能够延长转移性肺癌总生存期
6、c-Maf调控人γδ T17细胞，并与口腔癌进展相关
以上研究结果已经表明转录因子c-Maf调控小鼠的γδ T17细胞，而c-Maf在人γδ T17细胞中的作用尚不明确。健康人外周血中γδ T 细胞的占比小于10%，这些γδ T细胞主要由Vδ2 组成。外周血中的原代γδ T 细胞分泌的IL-17水平可以忽略不计，主要产生的是IFN-γ。有报道称，人γδ T17细胞表达CCR6，但只有少部分CCR6 γδ T 细胞(γδ T CCR6)在外周表达。
作者针对γδ T17细胞进行极化处理，发现γδ T 细胞在极化后扩增并产生更多的IL-17，而产生IL-17的γδ T细胞仅限于CCR6亚群 (图6A)。此外，与γδ T相比，γδ T中IL-17A表达水平也更高 (图6B)。IDH2 siRNA干扰显著降低γδ T中IL-17的产生 (图6C)。作者还观察到γδ T在mRNA和蛋白水平上均高表达c-Maf (图6D)。通过NIV抑制c-Maf，人γδ T显示IL-17生成减少 (图6E)。
图6 | 敲除γδ T细胞中c-Maf能够延长转移性肺癌总生存期
为了研究γδ T17在人类疾病中的调控作用，作者针对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)患者进行分析。结果发现大量的γδ T 细胞浸润在OSCC组织中，并且部分γδ T 细胞表达CCR6，以及这些来自OSCC的CCR6 γδ T 细胞也分泌了相当数量的IL-17 (图7A)。为了进一步探索人类OSCC组织中的γδ T 细胞，作者针对OSCC患者癌和癌旁组织进行了单细胞测序。通过scRNA-seq，发现了5种不同的γδ T 亚群 (图7B)。其中，亚群1和4高表达IFNG和TBX21 (图7C)，提示这两个亚群为γδ T1细胞；亚群5高表达c-MAF、CCR6、IL-17A和IL-22，而IFNG和TBX21表达水平较低 (图7C)，表明亚群5代表人γδ T17细胞。从分样本展示结果来看，OSCC组织中γδ T17细胞更多(图7B)。
针对代谢相关基因进行分析，亚群5中IDH1和IDH2在OSCC中高表达 (图7D)。与此相反，与癌旁组织相比，OSCC组织亚群1中IDH1和IDH2的表达水平降低。进一步使用公共数据集分析发现，具有低c-Maf表达和高γδ T 细胞浸润的头颈部鳞状癌(head neck squamous carcinoma, HNSC)患者的总生存率显著提高 (图7E)。这些数据表明c-Maf在介导人γδ T17细胞代谢重编程中的关键作用，并进一步提示靶向γδ T 细胞中的c-Maf可能成为肿瘤新治疗手段。
图7 | 人口腔组织中的γδ T17细胞
研究结论
作者证明了γδ T17和γδ T1通过不同的代谢途径发挥效应功能，并且发现转录因子c-Maf在γδ T17的细胞代谢中起关键作用。其中，c-Maf直接与IDH2启动子结合调节IDH2活性，从而直接调控限速酶IDH2参与调控细胞代谢。作者通过单细胞测序以及公共数据库分析，进一步证明在人类疾病中c-Maf通过调控γδ T17代谢重编程发挥相应效应功能，为未来肿瘤免疫治疗提供了新靶点。
致谢
特别致谢欧易生物技术工程师祖启东、姚晓华和子清珍在分析中提供的帮助。
参考文献
Chen X, Cai Y, Hu X, et al. Differential metabolic requirement governed by transcription factor c-Maf dictates innate γδT17 effector functionality in mice and humans. Sci Adv. 2022;8(21):eabm9120. doi:10.1126/sciadv.abm9120.
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