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解决复杂的肽谱分析，从攻克最复杂的样品前处理开始
在监测关键质量属性时，肽谱分析中的蛋白质消解是最复杂的样品前处理之一— 可能只有糖链分析的样品前处理能与之匹敌。安捷伦的肽谱分析指南中介绍了通用方案，但始终存在一些需要特别考虑的蛋白质或基质。这一过程包含多个步骤，事实上，成功的酶解需要从样品前处理，变性、还原和烷基化，酶解还有富集与净化等几个步骤来完成，每一步都需做出选择并可进行优化。认真考虑样品前处理程序对多肽分离和检测具有重大影响，细致且一致的样品前处理是获得高质量数据的第一步。根据我们的经验，总结出了以下窍门。
图为蛋白质酶解的四个步骤
全盘考虑样品前处理环节的关键因素
一些基质需要经过净化或调节，以实现更高效的消解。亲和捕获步骤可用于去除基质蛋白质（如白蛋白和免疫球蛋白），或基于 PTM（如磷酸化或糖基化）富集目标蛋白质。
如果计划使用 MS 进行检测，尽早考虑整个工作流程，仔细考虑所用的试剂以及用量。在净化步骤中去除样品中的这些蛋白质有多容易？它们是否将导致离子抑制？
考虑在整个过程中采用空白样品作为对照以实现故障排除的目的（通过任何富集和净化进行样品前处理）。
pH 可能是一个权衡项 — 较低的 pH 有利于防止脱酰胺基化，但许多蛋白酶在略微升高的 pH 下更有效。
变性、还原和烷基化必须做好的四件事儿
为了使蛋白酶有效进入裂解位点，必须使蛋白质变性并将二硫键还原和烷基化（当然，除非您想分析二硫键）。
如果使用尿素进行变性，切勿加热样品！否则将导致赖氨酸氨基甲酰化，通常我们不希望增加任何 PTM。
胍能够抑制蛋白酶活性，因此在酶解之前一定要稀释或去除胍。
高浓度或复杂蛋白质在变性步骤中易于沉淀，因此需特别注意。在变性前进行稀释可能有所帮助。
DTT 和巯基乙醇是非常臭的还原剂。TCEP 与 DTT 一样有效，而且它没有气味。请注意，在中性 pH 磷酸盐缓冲液中，它不是特别稳定，因此需要使用新鲜溶液。
最佳 pH 取决于所选择的酶解试剂
胰蛋白酶是最常用的蛋白酶，因为它的裂解非常明确且能够预测，但是如果胰蛋白酶的赖氨酸和精氨酸裂解无法产生用于分离和检测的合适肽段，则可以采用其他酶解试剂（我们将在后续文章中详细讨论这个问题）。最佳 pH 取决于所选择的酶解试剂，但酶解时间、温度和蛋白酶浓度是彼此依赖的变量，目标蛋白质和蛋白酶也是如此。
当 Lys 或 Arg 与 Cys、Glu 或 Asp 相邻时，胰蛋白酶裂解较慢，当Lyr或Arg之后是Pro 时，则完全不发生胰蛋白酶裂解1。
两次单独添加胰蛋白酶有助于实现完全酶解。
酶解后，使用 0.1% 而不是 1% 的甲酸来酸化样品。
许多方案规定了特定的温育或反应时间，但是如果您实施一种长期使用的方案，那么值得了解该步骤真正需要多长时间。有些实验人员会让反应持续 12 个小时，过夜后进行后续步骤。
胰蛋白酶（或其他蛋白酶）自溶可能导致肽谱中出现额外的峰。某些胰蛋白酶产物比其他产物更容易出现这种情况。如果您正在针对共流出进行故障排除或者试图鉴定未知峰，这是值得留意的一些情况。在这种情况下，空白对照可能有用。
胰蛋白酶的使用非常普遍，存在大量相关实验方案，Giansanti等人的 Nature Protocols文章。其中详细介绍了其他六种蛋白酶的消解方案，并讨论了各种蛋白酶的优缺点1。
研究特定 PTM 要消解后进行富集
如果您正在研究特定的 PTM，如磷酸化或糖基化，在消解后进行富集可能有所帮助。为实现成功的肽谱分析，通常需要进行净化，特别是使用 MS 检测时，因为盐可以显著抑制电离，进而降低灵敏度。
在 MS 分析之前对样品进行脱盐，以获得最佳灵敏度。盐可以显著抑制样品电离的程度。
如果样品看起来不透明或混浊，请在进样前进行过滤。
最后一条通用的窍门 — 一旦确定了方案，就要坚持下去！方案的任何变化都可能导致结果不一致和更多的问题。
下次再见 –
参考文献
1、P. Giansanti,L. Tsiatsiani,T.Y.Low,A.J.R.Heck.Sixalternative proteases for mass spectrometry-based proteomics beyond trypsin.Nature Protocols, 2016.
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