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高通量工艺开发技术(HTPD)| 千里马有了,你是那个伯乐吗?

GE生命科学
2019.7.03

高通量工艺开发方法(HTPD)已经成为基于QbD 理念的工艺开发的重要组成部分。该方法可谓「日行千里」,给工艺开发全面提速,可平行评估大量实验条件,全面了解工艺信息,获取特征空间,增强对工艺的理解,同时为后续工艺设计空间的确定以及生产放大奠定基础,有利于开发出稳健的工艺,缩短药物进入临床的时间(见图1)。


HTPD应用领域广泛,不仅可以在大规模细胞株构建阶段开展筛选实验,也可以用于早期工艺开发阶段纯化工艺条件的初步筛选。


图1 基于QbD 理念的工艺开发流程图



是马也,有千里之能


PreDictorTM96 孔填料滤板是 HTPD 的一种常规工作方式,也是一把利刃。它可以最大限度减少资源和时间的消耗,降低研发成本,缩短研发周期,提高实验效率,同时其实验结果可以有效进行统计分析,以保证其科学性和高效性。


PreDictorTM96 孔填料滤板上的工作流程与层析柱大同小异,主要包括平衡、上样、淋洗和洗脱这几个实验步骤(见图2)。板上同样遵循物料平衡的基本原则,板中填料与目标分子之间的基本相互作用也与层析柱中类似,两者之间最大的区别在于:PreDictor板以一种静态的方式去模拟层析柱上的层析行为。


图2 PreDictor板工作流程图



策之以其道,食之尽其材


为满足大家不同的实验目的,GE 开发了多种类型的PreDictorTM96 孔填料滤板,具体选择指南如下:


单一填料板(Single media plate)


  • 用于筛选结合、中间淋洗和洗脱条件;

  • 整块板中装填相同的填料体积;

  • 可提供三种不同规格的PreDictor板(2,5,20 ul);

  • 如PreDictor MabSelect PrismA 。


填料筛选板(Screening plate)


  • 用于同时在多种层析填料上筛选结合、中间淋洗和洗脱条件;

  • 预装填3或4种不同层析填料;

  • 如PreDictor AIEX screening plate。


吸附等温线板(Isotherm plate)


  • 用于考察在某平衡条件下的结合情况;

  • 预装填同一种层析填料但不同填料体积的96孔板,避免改变孔与孔之间的样品浓度,最大限度减小了误差;

  • 基于吸附热力学,获取结合强度(Kd)和潜在结合能力(qmax);

  • 如 PreDictor Adsoption isotherm plates。


定制款筛选板(Custom plate)


  • 可根据不同工艺开发需求定制专属的 PreDictor 板。



马之千里,盛装而临


Case Study 1

胰岛素原在离子层析填料上的

结合条件的筛选


选用 PreDictor AIEX screening plate和PreDictor CIEX screening plate 来考察胰岛素原在阴离子层析填料(Capto Q,Capto DEAE,Q Sepharose Fast Flow和Capto adhere)和阳离子层析填料(Capto S,SP Sepharose Fast Flow 和 Capto MMC)上,不同的 pH 和电导条件下的结合情况。具体实验设计如图 3 所示,通过检测不同上样条件下流穿的蛋白浓度换算得到相应的结合载量。


图 3 PreDictor AIEX screening plate 和 PreDictor CIEX screening plate 上实验设计示意图


分析结果后发现,Capto Q,Capto DEAE,Q Sepharose Fast Flow 和 Capto adhere 上蛋白全部流穿,因此排除阴离子层析填料以及复合填料 Capto adhere。


再分析 Capto S,SP Sepharose Fast Flow 和 Capto MMC 上的蛋白结合情况(见图 4),前两者的最高结合载量集中在低 pH,低电导的条件下,而 Capto MMC 在高 pH,150 mM NaCl 的条件下显示出比其他两种填料更高的结合载量。由于起始样品所处环境盐浓度接近 150 mM NaCl,并且高 pH 更有利于蛋白稳定,所以选择 Capto MMC 进行下一步研究。这个 case 印证了 HTPD 的通量之高,简单轻松就完成对 7 种不同层析填料的筛选。


图 4 PreDictor CIEX screening plate 上结果响应面分析



Case Study 2

Mabselect SuRe 上洗脱条件的筛选


选取 50 ul PreDictor MabSelect SuRe plate 来筛选 5 种单克隆抗体的洗脱 pH。在板中设置不同的 pH 值(3.0~5.8)以模拟 pH 洗脱梯度,具体实验设计如图 5 所示。


通过检测每种 Mab 在不同 pH 下洗脱下来的蛋白浓度换算得到蛋白回收率,从而筛选出合适的洗脱 pH 值,继而在 Tricorn 5/100 层析柱上进行验证,线性梯度从 pH5.0 到 pH3.0 洗脱 15 CV。


图 5 50 ul PreDictor MabSelect SuRe 模拟 pH 梯度洗脱步骤


图 6 中结果显示,不管是从 PreDictor plate 上蛋白回收率来看,还是从 Tricorn 5/100 层析结果来看,5 种单克隆抗体中,Mab1,Mab2, Mab3 和 Mab4 的洗脱 pH 都为 3.6,Mab5 的洗脱 pH 都为 4.8。


由此说明,PreDictor plate 不仅可以多维度,宽范围的进行条件筛选,并且与层析柱上的实验具有良好的相关性与重复性。


图 6 50 ul PreDictor MabSelect SuRe plate 与 Tricon 5/100 柱层析的洗脱模式比较



Case Study 3

Capto Q 上的弱结合模式条件的筛选


相比于流穿模式(flow-through mode),弱结合模式(weak-binding mode)通常更有利于去除聚集体和 HCP 等杂质,选取 PreDictor Capto Q Adsoption isotherm plates 来考察 8 个不同上样条件(2 个 pH × 4 个 cond.)下的结合强度 Kd 与相应潜在结合载量 qmax ,从而筛选得到阴离子层析填料 Capto Q 上的弱结合模式区间,具体实验设计如图 7 所示。通过检测每个孔中流穿的蛋白浓度,计算得到每孔填料上的蛋白结合量。


图 7 PreDictor Capto Q 等温线滤板上实验设计布局图


图 8 Langmuir 等温线,用以描述蛋白质吸附的热力学


根据 5 组平衡状态下液相与固相中蛋白浓度结果,可以绘制出 8 个不同上样条件下的 Langmuir 等温线,如图 8 所示,从而得到结合强度 Kd 值与潜在结合载量 qmax。当 Kd > 10 时,则为结合模式;当 Kd < 0.5 时, 则为流穿模式;当 0.5 < Kd < 10 时,就是我们所求的弱结合模式。


由此,可以发现 HTPD 不仅是单纯的用来筛选工艺条件,更是为工艺的操作区间从热力学角度提供科学依据。



哥家有马,只待你来!

高通量工艺开发技术(HTPD)在其利刃——PreDictorTM96 孔填料滤板的辅助下,成功完成了落实 QbD 理念的第一步。


在明确最终目标,熟知产品属性,理解层析工艺的基础上,结合科学合理的工艺设计与快捷高效的实验方法,避免大量原材料的消耗,极大缩短工艺研发时长,更为准确地把握层析预期效果。此悉工艺研发之利器,愿君亲之用之,则药品之上市,可计日而待也。



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