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高通量工艺开发技术（HTPD）| 千里马有了，你是那个伯乐吗？
高通量工艺开发方法（HTPD）已经成为基于QbD 理念的工艺开发的重要组成部分。该方法可谓「日行千里」，给工艺开发全面提速，可平行评估大量实验条件，全面了解工艺信息，获取特征空间，增强对工艺的理解，同时为后续工艺设计空间的确定以及生产放大奠定基础，有利于开发出稳健的工艺，缩短药物进入临床的时间（见图1）。
HTPD应用领域广泛，不仅可以在大规模细胞株构建阶段开展筛选实验，也可以用于早期工艺开发阶段纯化工艺条件的初步筛选。
图1 基于QbD 理念的工艺开发流程图
PreDictorTM96 孔填料滤板是 HTPD 的一种常规工作方式，也是一把利刃。它可以最大限度减少资源和时间的消耗，降低研发成本，缩短研发周期，提高实验效率，同时其实验结果可以有效进行统计分析，以保证其科学性和高效性。
PreDictorTM96 孔填料滤板上的工作流程与层析柱大同小异，主要包括平衡、上样、淋洗和洗脱这几个实验步骤（见图2）。板上同样遵循物料平衡的基本原则，板中填料与目标分子之间的基本相互作用也与层析柱中类似，两者之间最大的区别在于：PreDictor板以一种静态的方式去模拟层析柱上的层析行为。
图2 PreDictor板工作流程图
为满足大家不同的实验目的，GE 开发了多种类型的PreDictorTM96 孔填料滤板，具体选择指南如下：
单一填料板（Single media plate）
用于筛选结合、中间淋洗和洗脱条件；
整块板中装填相同的填料体积；
可提供三种不同规格的PreDictor板（2,5,20 ul）；
如PreDictor MabSelect PrismA 。
填料筛选板（Screening plate）
用于同时在多种层析填料上筛选结合、中间淋洗和洗脱条件；
预装填3或4种不同层析填料；
如PreDictor AIEX screening plate。
吸附等温线板（Isotherm plate）
用于考察在某平衡条件下的结合情况；
预装填同一种层析填料但不同填料体积的96孔板，避免改变孔与孔之间的样品浓度，最大限度减小了误差；
基于吸附热力学，获取结合强度（Kd）和潜在结合能力（qmax）；
如 PreDictor Adsoption isotherm plates。
定制款筛选板（Custom plate）
可根据不同工艺开发需求定制专属的 PreDictor 板。
胰岛素原在离子层析填料上的
结合条件的筛选
选用 PreDictor AIEX screening plate和PreDictor CIEX screening plate 来考察胰岛素原在阴离子层析填料（Capto Q，Capto DEAE，Q Sepharose Fast Flow和Capto adhere）和阳离子层析填料（Capto S，SP Sepharose Fast Flow 和 Capto MMC）上，不同的 pH 和电导条件下的结合情况。具体实验设计如图 3 所示，通过检测不同上样条件下流穿的蛋白浓度换算得到相应的结合载量。
图 3 PreDictor AIEX screening plate 和 PreDictor CIEX screening plate 上实验设计示意图
分析结果后发现，Capto Q，Capto DEAE，Q Sepharose Fast Flow 和 Capto adhere 上蛋白全部流穿，因此排除阴离子层析填料以及复合填料 Capto adhere。
再分析 Capto S，SP Sepharose Fast Flow 和 Capto MMC 上的蛋白结合情况（见图 4），前两者的最高结合载量集中在低 pH，低电导的条件下，而 Capto MMC 在高 pH，150 mM NaCl 的条件下显示出比其他两种填料更高的结合载量。由于起始样品所处环境盐浓度接近 150 mM NaCl，并且高 pH 更有利于蛋白稳定，所以选择 Capto MMC 进行下一步研究。这个 case 印证了 HTPD 的通量之高，简单轻松就完成对 7 种不同层析填料的筛选。
Mabselect SuRe 上洗脱条件的筛选
选取 50 ul PreDictor MabSelect SuRe plate 来筛选 5 种单克隆抗体的洗脱 pH。在板中设置不同的 pH 值（3.0～5.8）以模拟 pH 洗脱梯度，具体实验设计如图 5 所示。
通过检测每种 Mab 在不同 pH 下洗脱下来的蛋白浓度换算得到蛋白回收率，从而筛选出合适的洗脱 pH 值，继而在 Tricorn 5/100 层析柱上进行验证，线性梯度从 pH5.0 到 pH3.0 洗脱 15 CV。
图 6 中结果显示，不管是从 PreDictor plate 上蛋白回收率来看，还是从 Tricorn 5/100 层析结果来看，5 种单克隆抗体中，Mab1，Mab2， Mab3 和 Mab4 的洗脱 pH 都为 3.6，Mab5 的洗脱 pH 都为 4.8。
由此说明，PreDictor plate 不仅可以多维度，宽范围的进行条件筛选，并且与层析柱上的实验具有良好的相关性与重复性。
Capto Q 上的弱结合模式条件的筛选
相比于流穿模式（flow-through mode），弱结合模式（weak-binding mode）通常更有利于去除聚集体和 HCP 等杂质，选取 PreDictor Capto Q Adsoption isotherm plates 来考察 8 个不同上样条件（2 个 pH × 4 个 cond.）下的结合强度 Kd 与相应潜在结合载量 qmax ，从而筛选得到阴离子层析填料 Capto Q 上的弱结合模式区间，具体实验设计如图 7 所示。通过检测每个孔中流穿的蛋白浓度，计算得到每孔填料上的蛋白结合量。
图 7 PreDictor Capto Q 等温线滤板上实验设计布局图
图 8 Langmuir 等温线，用以描述蛋白质吸附的热力学
根据 5 组平衡状态下液相与固相中蛋白浓度结果，可以绘制出 8 个不同上样条件下的 Langmuir 等温线，如图 8 所示，从而得到结合强度 Kd 值与潜在结合载量 qmax。当 Kd > 10 时，则为结合模式；当 Kd < 0.5 时， 则为流穿模式；当 0.5 < Kd < 10 时，就是我们所求的弱结合模式。
由此，可以发现 HTPD 不仅是单纯的用来筛选工艺条件，更是为工艺的操作区间从热力学角度提供科学依据。
哥家有马，只待你来！
高通量工艺开发技术（HTPD）在其利刃——PreDictorTM96 孔填料滤板的辅助下，成功完成了落实 QbD 理念的第一步。
在明确最终目标，熟知产品属性，理解层析工艺的基础上，结合科学合理的工艺设计与快捷高效的实验方法，避免大量原材料的消耗，极大缩短工艺研发时长，更为准确地把握层析预期效果。此悉工艺研发之利器，愿君亲之用之，则药品之上市，可计日而待也。
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