RNA 完整性低,结果就一定差吗?是时候揭开真相了
RNA 测序如何做好样本质控,单看 RIN 值就足够了吗?为什么有的时候 RIN 值挺高的,但有些位点却怎么也测不到?研究小 RNA 的差异表达时是否可以参考 RIN 值?
针对这些 RNA 测序应用中经常遇到且困扰大家的问题,经验丰富的华大科技在 18 年夏天的直播课程中结合文献与华大的经验给大家做了精彩的分享。经由华大许可,我们将直播课程中的精华部分组织成了文字内容与大家分享。(讲师:宗亮,华大科技技术优化高级工程师,主要负责 RNA 测序技术的工艺优化及 Troubleshooting、自主测序平台的技术转移和技术支持。著有 SCI 文献一篇,发明专利四项。)
RNA 完整性常用参数 —— RIN 值RIN 值是安捷伦公司开发的以数字化形式表示 RNA 完整性的参数。RIN 值相比核糖体 18S:28S 的结果可信度更高
RIN 值反映总 RNA 的完整性,与样本浓度无关
- RIN 是基于以人、小鼠、大鼠为代表的哺乳动物开发的
- Ambion 的操作手册中讲到,RNA 的完整性对 GLOBIN 清除步骤以及下游应用的成功至关重要,即使是中等水平的 RNA 降解也会导致捕获试剂在清除球蛋白 mRNA 时的不充分
- 血液样本的保存、RNA 纯化的方法,以及残留 RNA 酶的活性都会影响 RNA 的质量
Illumina 的产品手册中要求 RIN 值要大于8,华大根据交付样本的大数据分析,建议交付的样本的 RIN 值大于7(关于 RIN 值的标准,用户可以根据现实研究经验进行设定)
- 通过 RIN 分析总 RNA 的完整性
- 对 6 个有代表性的与癌症发生相关的基因进行 RT-PCR 分析其转录本的变化
研究的结果是 RNA 质量未受运输过程的影响;关键基因的转录本的表达模式没有发生显著变化
只有当 RIN 值为 10 时,几乎可以实现对距离 3’端 0-5kb 区域的均匀覆盖(图 2, c)
一旦 RIN 值小于 10,就很难覆盖到距离 3’端大于 2kb 的区域了(图 2, c)
图 2, d 中,当 RIN 为 3 时,即使距离 3’端 1.5kb 的 ABL-BCR 也不能被很好的覆盖
- COSMIC(人癌症变异)数据库中,目前已知的融合基因产物的融合位点距离 3’端的中位数为 2.7kb,大约有 20% 融合位点距 3’端大于 5kb;5% 距 3’端大于 7kb
- 基于梅奥的研究结论:RIN 值小于 10 时,难以测到距离大于 2kb 的融合位点。也就是说当 RIN 值小于 10 时,至少有超过 20% 的融合基因的产物无论测多少深度都是测不到的
- 融合位点的成功检测基于两个因素:RIN 值、融合位点与转录本 3’端的距离
小 RNA 具有极高的稳定性,样本 RIN 值低也可以做小 RNA 测序,且定量结果可靠
小 RNA 的检测结果与建库方法有关
- 当只关心小 RNA 的差异表达时,即使实验方法、批次,甚至由不同公司开展检测,其数据的可信度和可比性仍然很高
1. 能否产生高质量的测序数据;
2. 对于已知转录本是否能够实现全长的覆盖;
3. 能否检出非编码的 RNA 序列(这对于医学研究特别重要);
4. 对于已知的基因,其定量的结果是否准确,例如与 QPCR 的方法或其它的方法学的结果相比较;
5. 当使用不同的样本量、降解程度时,其定量结果是否是可再现的(图 6)。
这篇文章的结论是:在应对不同起始量、不同 RNA 完整程度的样本时,不同的建库方案都有各自的优缺点;但针对不同完整性的样本,我们可以通过选择不同的实验方案来实现对样本内核酸信息的最大限度挖掘。文章提到,当使用 TruSeq 的建库方法,即使样本只有 5ng 时,其测序结果也不错;而对于严重降解的样本,文章认为 Access 的方法可能是更好的选择。图 6. 对不同样本用量和降解程度的样本,以三种不同实验方案进行 RNA 测序,得出的比较结果与建议。篇幅所限,我们无法百分百展示华大本次课程的全部内容。在本文的结尾,我们结合了华大专家的建议与安捷伦对 RNA 质控的经验与理解,与大家分享 RNA 质控的要点:1. RIN 值是评价 RNA 完整性的最为广泛应用的工具2. 在对转录本进行研究时,转录本的完整程度并不能与 RIN 值建立起直接关系,特别是针对某一条或某一些特定转录本时,其不相关性可能更为突出3. 在做表达谱研究时,可以将 RT-PCR 与 RIN 值结合在一起评估 RNA 的质量4. 以 Poly A 钓取方法检测基因融合时,除了 RIN 值,还要考虑融合位点与 3’端的距离5. 小 RNA 具有极高的稳定性,样本 RIN 值低也可以做小 RNA 测序,但检测结果与建库方法有很大相关性6. 实验设计时可以根据样本的类型、起始样本量、完整程度等对生信方案,建库流程进行调整以获得最优的测序结果参考文献:1. Duale N, et al. Human blood RNA stabilization in samples collected and transported for a large biobank. BMC research notes. 2012;5:510.2. Jaime I, et al. The impact of RNA degradation on fusion detection by RNA-seq. BMC Genomics. 2016; 17: 814.3. Winters JL, et al. Development and Verification of an RNA Sequencing (RNA-Seq) Assay for the Detection of Gene Fusions in Tumors. J Mol Diagn. 2018 Jul;20(4):495-511.4. Gallego Romero I, et al. RNA-seq: Impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biol. 2014 May 30;12:42.5. Lopez JP, et al. Biomarker discovery: quantification of microRNAs and other small non-coding RNAs using next generation sequencing. BMC Med Genomics. 2015 Jul 1;8:35.6. Giraldez MD, et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):746-757.7. Schuierer S, et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 2017 Jun 5;18(1):442.推荐阅读400 820 3278 (手机)
本文使用权归安捷伦科技(中国)有限公司所有,未经授权请勿转载至其他公众号,如需转载,请与工作人员联系,并注明出处。
长按识别二维码, 关注安捷伦视界
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章
-
微信文章