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Ä爱纯派 | 哥家PCC助力高效率的连续流生产
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抗体生产工艺中，随着上游动物细胞培养工艺的日渐成熟，培养体积逐年增大，表达量也是节节攀高，下游纯化压力也随之而来，无论是应对高表达量的Batch模式或灌流培养的连续收获模式，如何才能进一步提升下游层析工艺的生产效率及自动化程度？
GE的连续流层析设备ÄKTA PCC(Periodic Counter-current Chromatography）可以通过多柱位设计，实现双柱位串联上样，同时对完成上样的层析柱执行洗脱或后处理，通过UNICORN编程可以实现高度自动化运行，并且提升生产效率。
任何不以放大为目的的工艺设备设计都是耍流氓。
GE的连续流层析设备ÄKTA PCC，可以提供从实验室开发规模的ÄKTA PCC75到工业规模的1英寸系统，能满足从实验室级别到生产级别不同规模的无缝放大。
ÄKTA PCC有3柱位和4柱位可以满足的不同生产使用需求。下图为3柱位和4柱位的运行示意图，工业规模的BioProcess PCC还可以实现任意柱位串联的设计，以满足不同用户的个性化生产需求。
与传统的工艺层析相比，在使用PCC的连续流层析工艺中使用两根串联的层析柱进行上样，提高层析上样量的同时，流穿的样品可被串联上样流路中的第二根层析柱完全捕获，以提升填料的实际利用载量。下图中的4个曲线分别为层析填料的可用最大载量示意、测定载量时上样至10%穿透的流穿曲线示意、传统模式实际生产应用中的填料载量示意、在连续流层析工艺中层析填料可使用载量示意。
PCC的工艺中的串联上样终点可以基于固定上样时间控制；也可以基于上样UV的穿透值ΔUV控制，又叫动态控制。
时间控制即通过固定时间进行上样，需要在工艺开始前根据期望的上样穿透比例确定上样时间长度，这里设置的固定上样时间无法自行根据产品与填料的结合情况进行实时调整，例如为了避免出现上样超载通常需要按照料液的最高浓度和最小的柱体积计算最为保守的上样时间。
动态控制（Dynamic Control）是哥家PCC设备的独门绝技。
“动态”是控制的核心部分，串联上样时每根层析柱前后各有一个UV检测器，实时监测在线的UV变化，如下图，通过计算进样料液的UV值（UV Sample）和经过第一根层析柱后的穿透UV值（Breakthrough Curve）与基线（Base Line）的差值来计算ΔUV，在工艺开始前通过设定ΔUV来控制上样终点，可以实现对上样过程的实时动态监控，确保上样过程可以有效识别不同层析柱间的体积差异，并且根据实际料液浓度的变化或柱效的变化进行灵活的调整，以最大化利用填料载量。
如何应对层析柱间的差异及柱效的动态变化？
当不同层析柱间体积存在差异或填料载量在运行过程中出现变化时
上图为时间控制模式下，时间控制终点与工艺期望的上样流穿比例一致
上图为在时间控制模式下工艺期望的上样流穿比例在设定的时间点之前到达，设备将会继续按照设定的时间完成上样，导致填料过载，同理工艺期望的上样流穿比例在设定的时间点之后到达，设备将会按照设定的时间提前结束上样，导致填料载量不能被充分利用。
上图为基于时间控制和动态控制的对比，若是基于动态控制模式，实际的上样终点将会根据预设的上样穿透量ΔUV及时结束上样，有效避免上样量超出或低于工艺规定的范围。
上图使用3柱位的PCC系统进行实验，分别使用MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX按照相同的柱体积装填，使用相同浓度的样品，以填料载量为变量，按照动态控制模式运行。
图中灰色箭头标注的三个峰即为使用MabSelect SuRe的层析柱上样时对应的ΔUV曲线，可以通过蓝色的曲线（UV sample post）观察到当ΔUV达到预设值时该柱位的上样立即暂停，峰型的平头部分即为该柱位上样暂停时间。这样系统可以根据不同层析柱的实际装填载量动态准确控制上样结束时间，有效避免出现填料载量未被充分利用或出现高于工艺规定载量上限的过载情况。
时间控制由于无法实时判断工艺条件变化，即会有实际上样量大于或小于预设的终点的问题，造成层析柱上样量超过或低于预定目标，造成工艺的填料过载偏差或是填料载量不能充分的被利用，影响生产效率。
如何应对样品浓度的实时动态变化？
当灌流工艺需要持续上样时，上游发酵罐内的表达量每天都会发生变化，意味着上样的浓度也会实时产生变化，或Batch工艺中不同收集袋中的产品浓度存在差异。
如上图，若基于时间控制，当样品浓度高于起始浓度时，将会导致上样量超出工艺规定的范围，反之，当样品浓度小于其实浓度时，将会导致上样量低于工艺规定的范围。
如上图，基于动态控制模式下，当样品浓度高于起始浓度时，系统将会根据设定的ΔUV提前（准确）切换上样，当样品浓度低于起始浓度时，系统将会根据设定的ΔUV推后（准确）切换上样。
上图为基于动态控制情况下使用1g/L-2g/L梯度改变上样料液浓度的实验，工艺将根据预设的ΔUV判定每根柱子的上样终点，图中标注的3个不同的上样区间即为设备根据设定的ΔUV自行判断合理上样终点的表现，确保每根层析柱的上样量在工艺允许的范围内最大化，提高生产效率，同时保证层析工艺的稳定性及一致性。
如果基于时间控制，系统将无法根据样品的浓度变化自适应最优上样量，只能选择样品浓度最高的情况下允许的上样时间，这种情况下当样品浓度降低时，层析柱的载量利用率将会降低，无法保证填料的利用率。
举个栗子
传统Batch模式下，使用层析对细胞收获液中产品进行捕获时，需要人工根据填料载量范围计算样品的上样范围，这就需要细胞收获液保证混匀效果，提供一个准确的样品浓度。
当培养规模上升之后，收获的产品体积也随之增大，这时需要使用大型的Mixer进行混匀，这样硬件投入成本较高，转移产品增加染菌风险，耗时耗力。 PCC的动态控制便可以简化这一步混匀的操作，直接进行上样，设备可以根据工艺设定的ΔUV，自动根据浓度变化调整上样时间，实现稳定的工艺输出。
上样后冲洗（Post Loading Wash）是PCC设备的另一项独门绝技。
以三柱位为例，实际工艺运行过程中先由1号和2号层析柱串联执行上样，另外一根层析柱进行洗脱和再平衡，待1号柱上样至目标需求后切换至2层析柱上样，同时将第1号层析柱上的样品冲洗至3号层析柱，待1号层析柱冲洗完成后，将2号层析柱和3号层析柱串联，1号层析柱单独执行洗脱及再生。
通过这种在上样完成后将1号层析柱中未结合的产品冲洗至3号层析柱的操作，可以有效提升产品回收率约3%。
以下图连续运行10个Cycle的层析图谱为例，在实际的连续生产工艺中通过哥家的PCC设备可以实现连续稳定的工艺输出，不用担心工艺过程中上样料液浓度的变化，不用担心工艺过程中填料载量的变化，不用担心工艺过程中不同层析柱之间的装填差异，不用担心工艺过程中回收率的浪费，不用担心工艺放大的衔接，PCC系统可以轻松应对这些生产过程中的关键问题。
