拜泰齐贸易（上海）有限公司
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如何将HPLC反相纯化方法转换成Flash分离方案
在过去了10年时间里，随着化学小分子的研发逐步深入，越来越多的化学家们整投身于此，因此先导化合物的筛选和合成也逐渐变得复杂和多变，Flash的应用也从早期的以正相分离为主，慢慢向正反相多方法分离的方向转移。
这一改变，我们从公司的内部数据也可看出，从2012到2020年，反相色谱柱的消耗比例从10%上升到目前的40%左右，反相技术在Flash上的应用逐渐成为主流。
在上一篇的文章中，我们讨论了如何进行Flash反相分离的方法开发，同时我们经常有客户过来询问，如何将开发一个成功的反相flash方法，今天我们将和您一起探讨。
对于反相制备方法的开发，一般有两种方案可供您选择，一种是通过小（6g）的C18（反相）色谱柱直接进行分离方法的摸索，另一种则是根据分析HPLC的谱图进行Flash方法的转换，从而达到分离的目的。对于第一种方案，分离速度较快，方法摸索也会相对简单一点，不涉及方法转换等问题，但直接用Flash进行方法开发会消耗更多的样品和溶剂。
而对于第二种方案来说，方法的摸索可以在HPLC依次设定，全自动完成，会比较方便，当然也会消耗更多的时间，由于从HPLC到Flash之间，柱子的粒径大小填料都不相同，选择性和分离度都会有差异，因此需要更多的经验以及存在一些试错的成本。
下图1显示了使用通用的高效液相HPLC色谱柱进行flash方法开发的选择性问题。
图1. 采用同一样品和同一方法时，由于填料和系统不同，分离的选择性出现了一些不一致的情况。上图：通用HPLC色谱柱，下图：12g gram Biotage® Sfar C18色谱柱
那么我们该如何通过HPLC进行Flash分离的方法开发呢？最好的方案就是使用和Flash色谱柱相同填料的HPLC色谱柱，虽然目前市面上没有这种类型的色谱柱可供选择，但Biotage拥有超过20年以上此类色谱柱的装填经验，通过确定相同的填料和方法，两种模式下，每一种样品的出峰顺序都将会一致。
这个方案看上去还是比较合理和有效的，关键在于需要将单位柱体积转换成HPLC上面的时间，下面我们来看看具体是实施细节。
一般我会将梯度方法分为三个部分：
第一部分：起始比例，取决于样品溶解性，1CV
第二部分：从起始比例到最终流动相比例，10CV
第三部分：保持最终的流动相比例极性到结束，2CV
色谱柱的柱体积CV可以通过查看具体色谱柱的标签参数来获得，也可以通过强极性化合物极性计算，往往强极性化合物会在第一个CV时就出峰。
应用到具体的案例则是：此次我们使用的色谱柱为4.6*250mm的色谱柱，使用一个CV所消耗的时间为1.32min，流速为2mL/min，那么这根柱子的柱体积则为2.64mL。
图 2. Biotage® 4.6 x 250mm C18 色谱柱测试显示，在2mL/min的流速下，没有保留的第一个峰在1.32min出现，可以推断此柱子的柱体积为2.64mL。
随后我们将此条件建立了一个分离7个组分样品的基础方法：
第一部分：40% MeOH/Water，2.64min，1CV
第二部分：40% to 100% MeOH/Water 26.4 min，10CV
第三部分：100% MeOH，5.28 min，2CV
使用此方法分离之后，得到如下分离谱图，结果显示在连接有Biotage 4.6 x 250 mm C18 色谱柱的HPLC上，7个组分都得到了有效的分离。
图 3. 40%-100%MeOH/Watrer条件下，7个组分都得到了有效分离。
最终我们还是需要服务于大量的制备分离，因此我们将此方法直接复制到Bioatge Flash Selekt系统当中，通过一个12g Biotage® Sfär C18 色谱柱进行分析后的直接的放大分离制备，方法走完后，得到如下分离谱图：
图 4. 通过HPLC开发的方法进行的Flash放大制备分离
总体来说上下两个图谱的结果几乎一模一样，样品在此相同的条件下同样得到了有效的分离。唯一的区别在于，Flash条件下的时间显示稍长，原因在于Flash是哪个由于管路的增加以及上样方式的不同，导致其体积消耗更多，从而导致样品的出峰位置会出现后移的现象，但这并不影响其分离效果。
此次使用的Bioatge 12g C18色谱柱的柱体积为17mL，而这次非保留的样品的出峰位置在27.5mL，产生了10.5mL的延迟，此种延迟主要是由于柱子末端和检测器之间有较长的管线距离，在放大分离的设备当中，都会存在，但此种延迟并不影响其分离度和选择性。
表1. 同样填料同样的梯度条件下，HPLC和Flash的保留值（k''）和选择性（α）的对比
数据结果表明，各柱间的保留系数和选择性基本一致。
从以上的实验结果可以发现，如您需要通过HPLC进行反相Flash分离纯化的方法开发，使用相同填料的分析HPLC色谱柱会是最直接最简单的方法，无需调整方法，直接复制即可进行方法放大。
关于反相Flash分离，如您有任何问题，欢迎随时和我们联系和讨论。
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