最强实用攻略+新品推荐 | 方法开发时,如何选择 C18 色谱柱?
在色谱方法开发过程中,分离度、柱效、峰形是考察色谱柱选择性是否合适的主要性能指标。方法开发中的分离度根据分离度(Rs)公式,分离度的影响因素主要有柱效(N)、选择性(α)和保留因子(或称容量因子,k):(公式1)公式1作为分离度改善的理论基础。通常,方法开发过程中,通过提高化合物保留 (k)、提高柱效 (N)、以及提升选择性 (α) 来达到分离度的改善。选择性因子(α):(公式2)式中 k1 和 k2 分别是第一个峰和第二个峰的保留因子。根据公式 1 和公式 2,当选择性因子提高 0.1 时,对分离度的贡献是 Rs 大约为原来的 1.8 倍。因此选择性的改变对分离度的改善效果显著,如图 1 所示。图 1. 分离度与柱效、选择性、保留因子的关系与选择性有关的因素:
- 固定相:选择不同化学修饰的键合相(不同的 C18 柱或其它键合类型色谱柱)
- 流动相:调整有机相的类型、pH 值、盐浓度、两相比例等
柱温
- Poroshell 120 EC-C18 为封端的碳十八固定相,对酸性、碱性、中性化合物都有良好的选择性,已经成为方法开发的首选,也是在 Agilent 1260 Infinity II 四元泵液相色谱系统中标配的色谱柱。
- 与 EC-C18 柱不同,Poroshell 120 SB-C18 柱却是不封端的碳十八固定相。由于裸漏的硅醇基存在,可与待分离物发生氢键、离子间作用等,因此 SB-C18 的选择性与封端的 C18 柱存在显著差异。可以利用这个特点,在方法开发时 SB-C18 和 EC-C18 通常可以作为方法开发的起始色谱柱。另外,SB 的全称是 StableBond,顾名思义意为“稳定的键合相”,这里说的稳定,主要是在C18硅烷长链的两侧采用异丁基进行立体的保护,使得 SB-C18 在低 pH 下有较好的耐受性能。
同样采用 Poroshell 120 的硅胶,HPH-C18 与 EC-C18 和 SB-C18 又有所不同。在进行键合之前,在 Poroshell 硅胶的表面多孔层,先进行了有机杂化处理,再进行 C18 键合和封端修饰,得到的 HPH-C18 色谱柱具有了高 pH 耐受的特点。
在甲酸体系下,在进行液质联用分析时,CS-C18 柱提供可更好的灵敏度、响应和峰形。
图 6. 甲酸体系中低浓度标样(50ng/ml) 在 LC/MS/MS 中灵敏度比较更多精彩内容,尽在本期讲座四种不同的 Poroshell C18 柱还有哪些应用?新产品 Poroshell CS-C18 还有哪些优势和特性?方法开发过程中色谱柱的选择性是如何比较的?
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1. L. R. SNYDER , J. J.KIRKLAND, J. W. DOLAN. Introduction to Modern Liquid Chromatography, ThirdEdition.
2. 液相色谱手册-液相色谱柱与方法开发指南. 安捷伦科技.5990-7595CHCN
3. Agilent InfinityLabPoroshell 120 CS-C18 助您将 pH 值用作方法开发工具. 安捷伦科技. 5994-2274ZHCN
4. 使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 CS-C18 色谱柱改善碱性分析物的峰形. 安捷伦科技. 5994-2094ZHCN版权所有,违者必究。如需转载,请与工作人员联系。
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