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多肽和蛋白质的梯度和温度保留模型
ACD/Autochrom-Lc Simulator
引言01
在制药工业中，越来越多的蛋白质和多肽正成为研究对象。本文对多肽和蛋白质的作用保留模型进行研究。以期在反相色谱（RPC）和离子交换色谱(IEC)的准确建模，优化分析肽和蛋白质的分离。
用于优化小分子的分析规模分离的保留模型已经有30年的历史了。L.Snyder，P.Janderra，P.Schoenmakers等人已经发表了大量关于该主题的文章,并提供了几种商业软件，其中包括ACD/Labs AutoChrom 里的Lc-Simulator。
在定义涉及保留建模的肽和蛋白质的方法开发策略时，商业上可用的软件包无法准确地模拟蛋白质的保留。Novo Nordisk与ACD/Labs合作，研究了蛋白质和肽的保留机制，并在ACD/LC Simulator中建立相应的模型，已准确地模拟蛋白质和肽的保留时间。
ACD/Autochrom-Lc Simulator
梯度保留模型
02
如Snyder和Dolan1所述，在用数值解描述梯度洗脱中蛋白质的保留时，需要满足以下等度关系：
lnk = a + b x (等式1)
其中k是等度保留因子，a和b是系统和分析物的特定常数，x是强溶剂的比例。等式1适用于反相(RPC)和疏水作用色谱(HIC)。通常将其扩展为二阶项以解决非线性问题，如等式2。
lnk = a + b x + c x2 (等式2)
为了说明离子交换色谱(IEC)和亲水相互作用色谱(HILIC)的保留机制，需要以下方程式。
lnk = d + e lnx (等式3)
其中d和e是系统和分析物的特定常数，x是强溶剂的比例。
ACD/Autochrom-Lc Simulator
温度保留模型
03
对于小分子来说，同时对梯度和温度建模非常有效。然而，用以下等式4对蛋白质的温度进行建模时，表现出明显的不适用。
lnk = f + g / T (等式4)
f和g是分析物和系统的特定常数，T是色谱柱温度。
为了准确地说明蛋白质的保留（图1.），有必要添加一个二阶项.
lnk = f + g / T + h / T2 (等式5)
图1. 小分子和蛋白质的保留率随温度的变化
这可能与蛋白质结构在受热时发生变化这一事实有关。在低温时，蛋白质发生折叠，在中等温度时，蛋白质展开，随着温度的升高，与固定相相互作用的位点增多，蛋白质的保留时间也随之增加。当蛋白质在高温下完全展开时，开始表现为小分子，即随着温度的升高，保留量开始下降(图2)。
图2 蛋白质在不同温度下的保留行为
ACD/Autochrom-Lc Simulator
方法04
为了创建蛋白质模型，我们将等度保留模型与数值解结合使用，以计算梯度条件下的保留时间。在这项研究分别考察了六种分子量在25000Da的蛋白质在RPC和IEC模式下的保留。
图3. 用于构建(绿色圆圈)和验证模型(红色点)的实验
上图中的绿色圆圈表示用于拟合模型的实验数据，而红色圆点表示用于评估预测保留时间和峰宽的条件。对于简单的线性梯度，预测的准确度是ΔtR <2%，而Δw <20％ (图3)。 外推到大约20％似乎是合理的。
实验发现适用于一阶梯度的模型对更复杂的多阶梯度进行的预测评估具有非常相似的准确性，ΔtR <2%，而Δw <20％（图4）。
图4. 使用单步梯度构建的模型评估多步梯度的预测
峰宽预测中的20%误差听起来像是一个严重的问题，如下图所示，这对于优化目的是完全可以接受的（图5）。小分子和蛋白质之间的峰宽预测准确性没有差异。
图5 峰宽误差20％的影响说明
图6. 用户界面
可以得出结论，对于蛋白质，与小分子一样，可以在不同温度下对RPC和IEC梯度色谱法进行建模。由于蛋白质在高温下的解折叠，需要一个二阶温度模型。如Snyder1等人先前所述，HILIC和HIC也应该可以使用相同的模型进行建模。
Reference：
L.R. Snyder, J.W. Dolan, High-Performance Gradient Elution: The Practical Application of the Linear-Solvent-Strength Model, Wiley, Hoboken, NJ, 2007.
