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寡核苷酸分析 — 从高级表征到常规监测

沃特世

2021.7.22

治疗性寡核苷酸作为一类新兴的治疗方式，其潜力不断被挖掘，并引领着全球研发浪潮。然而，寡核苷酸的体积比传统的小分子大得多，其制备包含大量的合成步骤，典型的固相合成多步骤循环很大可能会引入杂质/无效序列，给分析和表征带来较大困难。另外，寡核苷酸类还具有某些特定的理化特性，例如：通常带有大量的负电荷、磷酸化产生PO杂质、嘌呤碱基水解形成脱嘌呤片段和核糖上的羟基，这些物质都很难与主产物和全长产物分离，所以寡核苷酸的开发通常会严重依赖质谱分析和定量。

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以往，很多研究机构会像Janssen公司一样，将高分辨率质谱用于高级表征和鉴定新型杂质。当确定了杂质和降解产物后，再尝试将这些方法转移到单四极杆系统上，跟踪这些杂质的存在和数量。

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图1. Janssen公司建立的两个互补寡核苷酸分析平台。

两个平台是互补的，一方面结合Q-TOF系统的MS/MS功能，获得更高的分辨率和质量精度。另一方面，又可以通过单四极杆提供的Empower软件实现QC友好性和GxP合规性。但有时的确很难将结果从高端表征平台转移到常规监测平台上。

正如Janssen R&D先进分子分析开发部的Thomas De Vijlder博士所言：

“

现在基于BioAccord系统，能够以符合GxP的方式将两方面优势整合在一个平台上进行。这是一个巨大的优势，也是我们选择BioAccord的出发点。

”

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图2. Janssen公司基于BioAccord系统建立的全新寡核苷酸分析平台。

让我们一起来看看这套基于BioAccord系统建立的“一箭双雕”的寡聚核苷酸方案可以执行哪些流程吧！

常规杂质谱工作流程

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图3. waters_connect界面

BioAccord系统在杂质谱分析流程方面的优势非常直接明确，它可以在UNIFI应用程序中添加预期能找到的杂质列表，并从样品中提取所有信息。如果之后发现了新的杂质，只需更新此列表并重新处理数据即可。此流程非常适合用于大批量合成确认，快速判断是否符合预期想要的结果！

直接将目标列表导入样品列表用于提交，极短运行时间内快速进行完整核酸分子量确认判断；

灵活的自定义计算，自动批处理去卷积和鉴定降解产物、产品杂质，计算质谱纯度，直接发送报告，精简分析过程。

图4. 简单的样品列表设置 - 只需把分子量输入列表即可。

图5. 清晰的组分列表及对应谱图

图6. 清晰的结果浏览

图7. UNIFI自动生成可视化报告

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鉴别和表征目标分子>0.01%低水平的杂质

创建UNIFI工作流程引导用户使用一系列数据浏览步骤，帮助快速回答相关问题，带来更高的效率和便捷性。

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图8. 深度表征和未知杂质鉴定，批次稳定性或对比分析等。

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图9. 自动化去卷积和修饰指认

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图10. 结果表显示了一系列预测到的修饰被鉴别到（与另外的非目标组分一起）。

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图11.可视化工具（稳定性和降解研究趋势总结，二元比对快速鉴别出批次间的新杂质）

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独特的序列分析工具带来额外价值

监管要求使用诸如MS/MS测序之类的序列敏感工具来进行寡核苷酸产品鉴别，从而实现放行测试。如图13所示，在MS^E或HDMS^E模式下获得碎片，确保我们可以返回调查任何杂质，而无须返回再做targeted MS/MS。

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图12. 在MS^E或HDMS^E模式下获得碎片

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图13. BioAccord的碎片峰（碎片谱图被输出到Spectrum Tools软件中，关联匹配到的峰与相应的指认）

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比如，我们要分析的目标序列是：

预期将会检测到质量数8583 Da，但是处理的第二个杂质峰8592 Da也被检测到了；9个Da的差异是由于T被A取代了，这也被UNIFI快速筛查方法所发现。那么链中到底是哪个位置不正确呢？毕竟有8个潜在的可取代位置。

BioAccord软件就可以快速显示序列失败在哪里。

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图14. 软件快速显示序列失败所在处

总结

合成寡核苷酸通过化学修饰可以增加其在生物体内的稳定性，但同时也增加了分析的难度。如何快速、准确地鉴别寡核苷酸的修饰类型和修饰位点也为其分析方法开发带来了挑战。BioAccord系统的引入，显示了桥接从高级表征到质量监测的潜力，既可以完成对杂质的剖析，还显示出对长寡核苷酸片段进行基于MS的序列确认能力，不失为一种高效便捷的选择。