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应用速递：食品安全-猪肝中磺胺类药物的含量测定
针对上述需求，默克Supelco®参考国标《GB 29694-2013 动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定》，建立了猪肝中13种磺胺类药物的HPLC检测方法，目标物结构如下图。磺胺类药物属于两性化合物，因此检测方法中使用Discovery® DSC-MCAX 混合离子交换萃取柱对猪肝基质进行净化，并使用Fused-Core®熔融核/核壳填料技术的Ascentis® Express色谱柱对目标物进行分离测定。
图1 13种磺胺类药物结构图
前处理步骤
预处理
将适量的解冻猪肝，切成小片，均质
溶剂提取
称取5 ±0.05 g于聚四氟乙烯离心管中，加入乙酸乙酯20mL，涡旋2min，于4000r/min下离心5min，取上清液于100mL鸡心瓶中，残渣中加入乙酸乙酯20mL，重复提取一次，合并两次提取液。
正己烷
除脂净化
鸡心瓶中加入0.1M盐酸溶液4mL，于40 °C下旋转蒸发浓缩至少于3mL，转至10mL离心管中，用0.1M的盐酸溶液2mL洗鸡心瓶，转至同一离心管中。再用正己烷3mL洗鸡心瓶，将正己烷转至同一离心管中，涡旋混合30s，3000r/min离心5min，弃正己烷。再次用正己烷3mL，洗鸡心瓶，转至同一离心管中，涡旋混合30s，3000 r/min离心5min，弃正己烷，取下层液备用。
SPE净化
SPE小柱
Discovery DSC-MCAX 固相萃取柱，100mg/3mL (52783-U)
平衡
依次用2mL甲醇，0.1M 盐酸溶液冲洗
上样
2mL 待净化液
依次
洗脱步骤
1) 1mL 0.1M盐酸溶液
2) 2mL 50% 甲醇乙腈溶液
3）4mL 氨水溶液（ 5ml 25% 氨水水溶液用甲醇稀释到100mL)
洗脱后
处理
将洗脱液在氮气下吹干，用1mL的甲酸乙腈溶液（取830mL的0.1%的甲酸溶液，用乙腈稀释到1L）复溶，用0.45 µm的滤膜过滤
色谱分离条件
色谱柱
Ascentis Express C18 5μm250*4.6mm (50538-U)
检测器
UV=270nm
流动相
A相: 0.1% 甲酸， B相: 乙腈（梯度见下表）
流速
1.0 mL/min
进样体积
100μL
柱温
30 °C
标准品
13种磺胺类药物混标，溶于流动相，2.5μg/mL
流动相梯度
时间 (min)
A (%)
B (%)
0.0
8317
5.0
8317
10.0
8020
22.3
6040
22.4
1090
30.0
1090
31.0
8317
48.0
8317
图2 检测图谱
1.磺乙酰胺 2.磺胺吡啶 3.磺胺噁唑 4.磺胺异噁唑
5.磺胺甲基嘧啶 6.磺胺二甲基嘧啶 7.磺胺甲氧嗪
8.苯酰磺胺 9.磺胺间甲氧嘧啶 10.磺胺氯哒嗪
11.磺胺地索辛 12.磺胺甲噁唑 13.磺胺吡唑
本方法中13种磺胺类化合物批次内相对标准偏差均小于1%，线性相关系数大于0.999，定量限为0.0004～0.018 mg/kg，低于国标检测方法及食品安全国家标准中磺胺类兽药残留限量。
样品前处理中使用的Discovery® DSC-MCAX 小柱，其填料同时含有C8和磺酸基键合相，可以从酸性或中性基质中有效的分离出碱性及两性化合物，因此非常适合磺胺类药物的提取净化。
此外，本方法在色谱分离时使用到Ascentis® Express熔融核/核壳结构色谱柱，和相同规格的全多孔柱相比，该柱可以在不增加背压的情况下有效提高柱效。和国标GB 29694-2013相比，本方法色谱分离时间减少1/4，但并未影响目标化合物的分离，因此可实现更高效的分析。
Ascentis® Express C18
系列色谱柱
货号
25cm X 4.6 mm, 5μm
50538-U
15cm X 4.6 mm, 5μm
50537-U
10cm X 4.6 mm, 5μm
50536-U
10cm X 4.6 mm, 2.7μm
50461-U
15cm X 4.6 mm, 2.7μm
50462-U
10cm X 2.1 mm, 2μm
50813-U
Discovery® DSC-MCAX
系列固相萃取柱
货号
50mg / 1mL
52781-U
100mg / 1mL
52782-U
100mg / 3mL
52783-U
300mg / 3mL
52784-U
300mg / 6mL
52786-U
Millex® 针式过滤器
货号
亲水 PTFE, 13mm, 0.20 μm
SLLGX13
亲水 PTFE, 13mm, 0.45 μm
SLCRX13
亲水 PTFE, 33mm, 0.20 μm
SLLG033
亲水 PTFE, 33mm, 0.45 μm
SLCR033
标准物质
级别货号
磺乙酰胺
CRM
PHR1498
磺胺吡啶
分析标准品
31738
磺胺噁唑
分析标准品
46866
磺胺异噁唑
分析标准品
31739
磺胺甲基嘧啶
CRM
PHR1577
磺胺二甲基嘧啶
分析标准品
46802
磺胺甲氧嗪
分析标准品
46858
苯酰磺胺
分析标准品
46762
磺胺间甲氧嘧啶
分析标准品
32091
磺胺氯哒嗪
分析标准品
46778
磺胺地索辛
CRM
PHR1448
磺胺甲噁唑
CRM
PHR1126
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