精彩回顾丨病毒类递送载体AAV的研发与工艺技术沙龙

SCIEX

2021.9.28

2021年9月10日，丹纳赫生命科学携手医麦客开展了系列沙龙中的首场活动，主题为《病毒类递送载体AAV的研发与工艺技术》。

近年来，全球共两款AAV基因疗法获批上市，包括治疗眼部疾病的Luxturna和靶向中枢神经系统的Zolgensma。国内在2021年上半年也接连批准了纽福斯的NR082和信致医药的BBM-H901注射液这两款AAV体内基因治疗药物进入临床，进一步推动AAV成为业界关注的焦点。

AAV基因治疗作为目前最热门的细分赛道，国内有越来越多的生物技术公司投身至此，但是日前也有一些新闻，如安斯泰来的基因治疗管线临床搁置，展现出对AAV载体的担忧和顾虑。

由此，此次沙龙邀请了辉大基因BD副总裁张瑜先生、博腾生物首席技术官孔令洁博士、贝克曼库尔特生命科学离心机产品经理叶苗先生和丹纳赫生命科学应用科学家徐玲丽女士四位业内大咖来为大家分享AAV基因治疗研发与开发上的一些经验，增强参与者对AAV领域技术和分析方法的了解，希望能够促进AAV基因治疗领域的技术创新，推动中国生物医药领域交流，助力中国生物制药人才不断发展。

沙龙精彩回顾

▲丹纳赫生命科学市场发展总监周伟华

首先本场沙龙请到丹纳赫生命科学市场发展总监周伟华女士开场致辞。基因治疗难做，AAV更难做，但是基因治疗一定是未来的主要治疗手段，能从根本上治愈疾病。国内的AAV基因治疗才刚刚启航，但是挑战已经接踵而来。

辉大基因BD副总裁张瑜：AAV基因治疗药物的开发的前沿进展

▲辉大基因BD副总裁张瑜

基因治疗中分为两类，一种是体外（ex vivo）基因治疗，最典型的如CAR-T疗法，另一种是体内（in vivo）基因疗法，主要以使用AAV病毒载体为主，将基因修饰工具引入到目标基因上，对目标基因进行修饰，达到治疗目的。

基因治疗的概念是1972年正式提出的，在1990年进行了第一次临床试验。2003年中国上市了全球第一个广义上的基因治疗产品今又生，是一款p53腺病毒注射液，用于治疗肿瘤。除今又生外，至今为止全球共批准了五款基因治疗产品。

相对病毒类载体，还有一类非病毒载体，如脂质纳米颗粒（LNP）等。其他的还有逆转录病毒载体、甲属病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体等，多见于罕见病和慢性病的治疗。

AAV载体的优势很多。如单链DNA既可以感染的细胞类别较广，同时不会整合到人体基因组中，并且免疫原性相对较低，可以长时间存在。但是其弱势在于，AAV载体携带目标基因的容量最好不要超过4.5kb，可包装的基因片段较小。大约有30%的遗传病基因超过了4.5kb，限制了AAV基因疗法的应用。

在过去的近50年中，人类发现了不同的基因编辑工具，极大地拓展了基因治疗的应用，包括CRISPR Cas9、TALEN、ZFN、CRISPR Cpf1等，各具不同的优点。

Cas9系统目前是更灵活、更易成药、脱靶率最低且成本最易控制的选择。张瑜先生以已经应用到临床试验中的EDIT-101和NTLA-2001为例，阐述了Cas9系统在基因治疗产品中修饰人体编辑DNA的实际应用。

在创新的基因编辑工具中，张瑜先生介绍了辉大基因2020年开发的创新RNA编辑器工具Cas13X/Y，体积较小，但依然可以敲除至少4个基因，脱靶率较低，借此展现了基因编辑工具越来越小同时追求更高的效率的趋势。

张瑜先生提到，基因治疗在过去十几年间得到大力发展，究其原因有几个重要因素：基础科研的推动，资本的青睐与支持，迫切的临床需求，积极有效的监管和已验证的技术路径。

接下来基因治疗还面对着不小的挑战。在产品研发方面，需解决脱靶问题、提高编辑效率、开发更小的系统，将基因治疗的适应症从罕见病向慢性病扩展。在递送系统方面，还需提高组织特异性，降低毒性和免疫原性，使其更易生产和储运，增强可调控性。在实际CMC生产方面，未来还需建立统一且优化的行业标准，提高生产效率，提高生产工艺的稳定性，提供可靠的CDMO服务，多方面改善，以达到降低成本的核心要求。由此，推进基因治疗产品更好地通过注册审批。

博腾生物首席技术官孔令洁：AAV载体的工艺开发

▲博腾生物首席技术官孔令洁

目前市场上主要的两类AAV包装系统分别是HEK293转染体系和昆虫细胞杆状病毒包装系统。

HEK293系统使用三质粒直接转染HEK293细胞，周期较短，但缺点是产量低、成本高，工艺难以放大。

昆虫细胞系统产量更高、成本低、空壳率低，工艺相对容易放大，但缺点是由于增加了病毒制备过程，因此周期长，杆状病毒的不稳定性会影响工艺放大，并有VP1/2/3比例引起的感染力问题和潜在的昆虫弹状病毒问题。

孔博士同时介绍了两类AAV生产包装系统的工艺流程对比。在上游工艺中，昆虫杆状病毒细胞的步骤相较更为复杂，需要经过载体设计、杆状病毒制备、转染Sf9细胞、单噬斑筛选和鉴定、病毒扩增等步骤。除了昆虫细胞系统需要额外的除病毒工艺外，二者下游的纯化工艺基本相同，目前已经能够良好地去除空衣壳。

昆虫细胞系统有其特有的技术壁垒，包括：早期的昆虫细胞体系包装的AAV相比HEK293系统感染力低，杆状病毒的基因组不稳定，和潜在的昆虫弹状病毒问题。尽管昆虫细胞系统有较低的空壳率，但通过分子设计和工艺改善，还可以更加减少空壳病毒。孔博士介绍了目前的解决方法和未来发展方向，部分问题已经得到改善，但专利壁垒比较高。

贝克曼库尔特生命科学离心机产品经理叶苗：AAV载体的分离纯化及空壳率检测

▲贝克曼库尔特生命科学离心机产品经理叶苗

目前的离心机样式具有多样性，随着样品的分离要求，包括体积要求，在不断地变化，如台式微量离心机，台式高速离心机，然后再到兼顾了体积和离心力的落地高速或者落地大容量离心机，一直到追求极限离心力的超速离心机，包括台式超速离心机等等。

离心机的主要的功能是对生物颗粒的分离制备，了解所需要分离的生物颗粒的沉降特性尤为重要，所以沉降系数生物颗粒是非常重要的一个物理参数。知道了沉降系数后，就可以针对性地采取不同的离心方法。

最简单、最直接的一种离心方法就是沉淀和差速法，它的特点是比较快速简单，一般适用于沉降系数差值比较大的生物颗粒的分离。缺点是分离精度较差，纯度包括得率都较低。

若需求较好的分离精度，通常使用密度梯度离心的方法，在工业上常见用于分离病毒载体和操作性质粒DNA的是等密度梯度滤芯。叶苗老师介绍了密度梯度离心主要的分类和应用条件，并介绍了密度梯度超速离心机（DGUC）的离心纯化流程和应用的类型。

通常认为该方法的主要缺点是其通量和体积较小，但叶老师展示了相关文献中显示，通过实验设计和参数优化，可以在有限体积内提升其分离通量，提高4倍的效率。

分析超离心法(AUC)可以精准监测AAV载体的空壳率，并对蛋白质、低聚物、聚集物、胶体、纳米颗粒、病毒衣壳、VLPs、细胞外囊泡和其他小结构分子进行表征。因此AUC可以用于筛选病毒载体和扩大生产质量检测。叶苗老师也通过展示AUC检测空壳率的流程，展示了AUC的系统组成和相对电镜法的技术优势，并以诺华的专利AAV基因治疗产品为例，阐述了AUC检测AAV空壳率的实际表现。

丹纳赫生命科学应用科学家徐玲丽：毛细管电泳对AAV载体的表征