【精彩回顾】丹纳赫生命科学沙龙：病毒递送载体AAV的质控挑战

丹纳赫生命科学

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【精彩回顾】丹纳赫生命科学沙龙：病毒递送载体AAV的质控挑战

丹纳赫生命科学

2022.4.15

基因治疗行业近年来可谓是蒸蒸日上，国际上和国内均在不断推出新的进展。其中，对AAV这一基因治疗病毒载体的开发与研究，也一直获得了较高的关注。AAV作为目前市场占有率最高、也最成熟的病毒递送载体，市场需求庞大且日益增长，但也面临着前所未有的质量分析挑战。

因此，丹纳赫生命科学联合医麦客和派真生物，于2022年3月31日在广州生物岛举办病毒递送载体AAV的质控挑战主题沙龙，共同探讨AAV的质控方法应用进展，推动AAV工艺开发向大规模GMP级商业化阶段转化成熟。

开场致辞嘉宾

丹纳赫生命科学高级市场开发经理姚南博士

派真生物质量总监周泽鑫：AAV分析质控挑战及研究策略

目前获批上市的三款AAV基因疗法中，从Luxturna到Zolgensma，从局部注射到全身注射，这说明AAV载体的免疫原性问题已经得到了一定的解决。FDA也积极依据技术和产品的新突破，间隔三年即对指南进行修正。国内的法规指南也在加速出台阶段，例如2020年中国药典中新增的《人用基因治疗总论》，为国内AAV基因疗法发展提供推动环境。

但作为大环境的纲领性支持，监管机构目前尚未对具体检验项目给出明确质量标准，这也带来目前的几大挑战：

1. AAV不同血清型的性质差异影响工艺开发标准化

2. 同一质量属性的表征方法选择缺乏共识

3. 缺乏空白标准品

4. 缺乏样品量标准，原液消耗严重

例如空壳率是AAV生产工艺中的重要控制指标之一，然而目前对于生产工艺中空壳率的限度标准尚未形成行业的共识，从3%、10%到30%的情况均存在。过高的空壳率会对AAV基因治疗药物临床上免疫原性、药效等多方面带来很大的挑战。

但在标准的制定上，也不能过度追求低空壳率等问题，需在质量和产量之间寻找最优的平衡比例。例如利用密度梯度离心工艺能够轻松达到5%以下的空壳率，但不容易放大和量产。而目前业内常用的可以规模化纯化AAV的工艺，空壳率往往在10%到30%之间。因此，需要根据不同的情况选择合适的工艺。

如何在整个质量检测流程中选择可靠的公认检测方法，也是目前AAV生产行业面临的挑战。CDMO在建立生产工艺体系的过程中，目前无法囊括所有检测方案，也是未来待解决的挑战之一。

此外，不同设计的AAV衣壳在体内和体外的感染有效性存在较大差异，使得体外模型的标准化尚存在较大挑战，同时干扰AAV生产工艺的设计时，通过体外模型预测体内活性的效价问题。

目前，派真生物等CDMO对于早期研究中标准化和样品等挑战的解决方案包括：

1.增加表征更新，尽量统一对表征的解读共识

2.对不同检测方法的适用范围进行筛选，建立区分方法和质控方案的策略

3.系统性建立标准物质的指标，建立数据库和材料库

4.通过交叉对比验证以上检测方案的可及性

例如，不同基因、不同作用目的的PCR结果可能存在高达10倍的偏差，但通过GMP质量控制，可以大幅降低其三个靶基因引入带来的误差。对于空壳率的多重检测带来的低准确度问题，需要建立指导性的分析方法来辅助。但目前，不同来源或不同血清型的AAV检测，在实际检测操作过程中，可能存在操作运输问题或本身特性导致的假阳性，需进一步进行质控与技术优化。

国内的AAV质量控制与分析目前已经逐渐建立了在标准制定、方法选择、开发确认和验证等全面系统性方向上的意识，其早期工艺开发也需进一步发展，向GMP级生产转化。

合肥星眸生物科技有限公司才源博士：神经领域AAV药物的研究进展及质量要求

眼科基因治疗是目前基因疗法中走在最前沿的靶点之一，具有广阔的市场转化前景。对眼科神经系统而言，虽然创新的AAV衣壳能够在生产成本和安全性上带来质的飞跃，但对于质控而言挑战也同样是巨大的。

目前眼科AAV疗法针对基因突变导致的罕见病较多，星眸生物也在2019年就推出了一种可提高在体同源重组效率的基因编辑技术TRED技术，在一定程度上阻止视网膜素变异模型中视杆细胞和视锥细胞的退化丢失，从而修复其功能。

但如果从临床需求出发，根据2020年柳叶刀发布的全球眼健康的一篇相关研究，真正导致失明的诸多病因中，AMD在欧美国家占比很高，在东亚相对较低，但国内AMD患者群体却在快速增长，2025年或将超过4000万人。这也是星眸生物目前看好的核心赛道。在这条赛道上，虽然已有罗氏、诺华等大厂的抗体药物推出，但AAV基因疗法能够解决抗体药物需要定期注射的缺点。

AAV基因疗法通过不断迭代，维持其给药后体内抗体水平高表达的稳定性，同时依靠其相对缓慢的抗体表达来降低耐药性。国际上，艾伯维和Regenxbio高达17.5亿美元的合作也证明了行业对该方向的期待。同时，眼科AAV基因疗法给药方式从视网膜下注射到脉络膜上腔或者是双膜下腔注射，国内也在向这一方向迭代和改进，并期待能够开发定向感染的新型衣壳。

据2019年高光坪教授关于AAV生产的一篇研究显示，整体生产流程中三大质控要点包括：1.大规模生产的成本；2.质控标准化的过程；3.AAV递送的免疫原性。而在眼科基因疗法领域，首先，以Luxturna为例，其年需产量仅有1.2x10^13个左右，相对全身给药的基因疗法，剂量差距可达4个数量级，生产规模相对偏小；其次，视网膜区域为免疫豁免区，无需过分担忧免疫原性；因此，最主要的问题便在于建立一致化标准。

虽然QC质量控制和监管机构审批的要求更偏向严格的安全性和有效性，而不考虑生产和开发的成本，仍需研发企业寻找平衡点，但是以目前预估的生产规模和发酵体系规模而言，若能顺利克服批量化生产的现存挑战，未来AAV基因治疗的产品价格或将走在以千升为常见发酵体量的抗体药物之下。

SCIEX公司应用工程师王文涛：AAV的衣壳蛋白表征方案

对于细胞和基因治疗产品，其中蛋白和基因组的表征分析要求更为严格。毛细管电泳和高分辨质谱是目前常见的蛋白分析手段，基因组分析包括基因组完整性和前期质量标准的构建等。

从AAV的生产流程而言，前期质粒分析中毛细管电泳作为超螺旋比例的检测分析方法，目前已进入2020年中检院的标准提升项目中，并于2021年完成了全国性的联合验证。

AAV质量控制标准化体系的建立虽然尚未成型，但是检测分析方法的选择依然存在部分模块化的标准性共识。例如，涉及SCIEX相关产品的包括：目的基因鉴别、衣壳蛋白表征和宿主细胞残留DNA检测等。在研发阶段利用高分辨质谱测定AAV衣壳蛋白完整分子量及序列覆盖度等指标。在下游病毒载体原液及包装后需要使用毛细管电泳等分析方法进行AAV衣壳蛋白纯度分析。

SCIEX的毛细管电泳具有循环冷却控温系统，可以保证检测结果的稳定性和重复性。高分辨质谱可通分子量和氨基酸序列来分析AAV衣壳蛋白结构，可对VP1、VP2、VP3三种结构蛋白进行定量，准确分析翻译后修饰等数据，从而筛选合适的细胞系。

相对于常规的早期检测方法，毛细管电泳能更好地监控AAV的纯化过程，并能提供更高的分辨率，其灵敏度还足以满足NMPA在2020年发布的《基因治疗产品药品研究与评价技术指导原则》中对HCD片段大小的要求，也符合FDA目前的指南要求。王文涛老师就此介绍了SCIEX毛细管电泳和高分辨质谱在不同检测应用中的具体效果。其毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统已经历十几年的市场考验，ZenoTOF™ 7600则是SCIEX目前最高端的一款高分辨质谱系统，进一步提高了灵敏度与分辨率。

Beckman Coulter高级产品专家王聪：AAV的实验室纯化及空壳率检测

超速离心机除了常见的制备型，还有分析型。制备型超速离心机可用于提纯制备各种生物样品，而分析型超速离心机（AUC）可用于蛋白或病毒等生物样本的表征。

AAV体积较小，分离纯化中所需的离心力较大，因此需要使用超速离心机进行样品的纯化制备。在AAV纯化的过程中，普通的沉淀法操作已经无法达到所需分离精度，通常需要结合使用密度梯度离心法，可通过速率区带离心法来放大各组分的沉降速度差异性，提高分离效果。也可通过等密度梯度法分离不同密度的样品，提供更高的分辨能力，通过该方法甚至能够纯化出空壳和满载病毒颗粒。

目前，超速离心与层析法依然是AAV分离纯化的主要工艺，虽然如何将超速离心法应用到大规模生产中还面对着一些困难，但已有不少方法学上的优化策略。例如优化梯度液的组成，切向流浓缩后再离心纯化等操作，可将纯化通量提高高达7.5倍。

AUC通过吸收光检测器和干涉光检测器来检测样品池中样品沉降时的浓度变化曲线，计算出其沉降系数、相对分子质量、粒径等参数，适合蛋白、核酸、脂类等生物大分子的表征工作。

作为行业公认的标准方法之一，AUC非常适合进行AAV空壳率检测。其具有良好的一致性，较高的分辨率，能够准确反映不同生产工艺结果的细微质量差别，适用于产品研发和放大过程中的质控管理。诺华的AAV基因疗法Zolgensma正是采用了该方法学来检测其生产的AAV药品质量。

除了经典的AAV空壳率检测，AUC同样适用于蛋白质聚集体、VLP病毒样颗粒的组装、大分子样品间相互作用的表征和检测，助力抗体药物、疫苗的研发和生产质控，我们也期待更多方法学的开发。

分享过后，现场众人前往丹纳赫中国生命科学研究院广州应用研发中心进行参观交流。