2021诺贝尔奖得主教你用BLI技术“感知痛觉”！

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2021诺贝尔奖得主教你用BLI技术“感知痛觉”！

赛多利斯实验室

2021.10.09

近日，David Julius和Ardem Patapoutian因发现温度和触觉感受器而被授予2021诺贝尔生理学或医学奖。David Julius团队在感觉神经纤维上发现了被热、冷或化学刺激物激活的离子通道，提供了对热感觉、疼痛和瘙痒过程的分子级洞察。离子通道是一类物质交换的膜蛋白，其中有一种TRPA1离子通道，又称芥末受体（wasabi receptor），是特异表达于初级传入神经元（感觉神经元）上的跨膜受体。记得第一次吃芥末的那种酸爽吗？就是它的作用! 更关键的是TRPA1被认为是治疗慢性疼痛和瘙痒的潜在靶点。

2021诺贝尔生理学或医学奖获奖者：David Julius 和 Ardem Patapoutian

图片来源
guokr.com/article/460413/

2019年David Julius课题组在《Cell》杂志发表题为A Cell-Penetrating Scorpion Toxin Enables Mode-Specific Modulation of TRPA1 and Pain的文章，找到了来自于澳大利亚黑石毒蝎毒液的一种特异高效的TRPA1激动剂，并揭示了其作用机理，这种激动剂是被称之为“芥末受体毒素”（WaTx）的多肽。

激动剂WaTx的结合机理

脂质体融合实验发现WaTx能够深入细胞膜，与TRPA1的胞内段结合。那结合位点在哪里呢？NMR结构解析发现，TRPA1胞内段还真的有一个口袋可能结合WaTx（如图1所示）。

图1. TRPA1胞内段的可能与WaTx的口袋，其中P622是一个重要的口袋组成氨基酸位点

离子通道与拮抗剂/抑制剂（可能是一种毒素或者药物）的相互作用是揭示其机理重要的一步，而BLI（生物层干涉）技术是最直接的检测两者相互作用的方法，使用BLI技术检测WaTx和TRPA1的互作是必要的。

不过问题又来了，离子通道蛋白是一种膜蛋白，其表达纯化一般很困难，即使能表达也只表达某一段（比如胞外段）。并且膜蛋白的缓冲液也是比较苛刻的，一不小心就全军覆没。如果能用膜提取物取代纯化的蛋白做相互作用，就可以解决很多包括各种膜受体和离子通道的亲和力检测问题了。赛多利斯Octet®分子互作分析系统基于BLI技术，能够检测浓度很低的TRPA1粗提物。

使用Octet®检测TRPA1粗提物

作者在用BLI检测前，先算了一笔账，如果细胞的浓度为2×10⁶/mL，一个细胞上大概有1000个离子通道。那么阿伏伽德罗常数一除，这些细胞悬浮液的膜提取物中TRPA1的浓度约为 (2×10⁶×1000×1000)/(6.02×10²³) = 3.3×10⁻¹²，大概为pM级别。考虑到膜提取的损失，就定为1 pM吧。这些数字不是拍脑袋想出来的，是通过电生理方法验证过的。即使在如此低的浓度下，只要亲和力高，用Octet®也是可以检测出来的。

作者用SA（链霉亲和素）传感器固化Biotin-GSGS-WaTx，然后与表达人TRPA1细胞的膜提取物（总蛋白浓度为0.5 mg/mL）结合解离，结果如图2所示：