LC3双荧光自噬慢病毒的应用(下篇)——数据分析及实验小Tips
上一期们介绍了LC3双荧光自噬慢病毒的实验原理及病毒使用,那么后续实验数据如何处理?操作中有哪些小技巧及注意事项呢?今天就跟小编一起挖掘一下吧~
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(一)结果判定标准
1、诱导处理
a) 红/绿色共定位的点状聚集(黄色斑点):早期自噬小体的生成;
b) 绿色荧光淬灭,只有红色斑点聚集:自噬晚期自噬溶酶体的形成。
2、抑制处理
a) 感染野生型LC3的实验中黄色和红色斑点数量都下降:自噬流在早期被抑制;
b) 黄色上升,红色下降:自噬流在晚期被抑制。
总结成自噬流的判定标准如下表所示:
自噬流变化 | 本底 | 自噬流发生 | 早期抑制 | 晚期抑制 |
Red+Green+(黄色斑点) | - | 上升 | 下降 | 上升 |
Red+Green-(红色斑点) | _ | 上升 | 下降 | 下降 |
(二)数据分析
以雷帕霉素(Rapa)药物处理Siha细胞为例(实验数据来源于吉凯平台)。
CON | 感染自噬慢病毒,加溶剂处理的细胞 |
CON+Rapa | 感染自噬慢病毒,加100nM终浓度的 Rapa 处理细胞 |
NC | 感染自噬慢病毒,再加入阴性对照慢病毒感染的细胞,分别在细胞贴壁后6H检测 |
OE | 感染自噬慢病毒,再加入目的基因过表达慢病毒感染的细胞,分别在细胞贴壁后6H检测 |
Average dots count per cell:红色荧光及绿色荧光各组的平均荧光值:
Relative dots Count Red/Green:红色荧光与绿色荧光强度的比值:
相比CON,加入Rapa后自噬体明显增多,自噬流向自噬溶酶体流动,Relative dots Count Red/Green升高(和预实验结果相符),P小于0.05。证明本次实验结果可信。
相比NC组,OE组3个时间点的Relative dots Count Red/Green无明显变化,P大于0.05。提示该基因可能对Siha细胞自噬体向自噬溶酶体的流动无明显作用。
(三)关于实验小Tips
Q
为何细胞感染自噬慢病毒后各个组别
均有自噬体产生?
A:细胞自噬属于正常的细胞生理活动,在饥饿的情况下也会有大量的自噬现象发生,故在培养过程中,注意更换新鲜培养基、 维持细胞密度在80%左右,保证细胞营养充分。
Q
感染后的细胞是否可以直接用于
自噬诱导?
A:自噬慢病毒感染后,由于慢病毒以及感染试剂对细胞有—定的毒性,细胞需要—定的适应时间,并且慢病毒感染后,细胞中荧光标记蛋白表达还不稳定,不能很准确的判断感染效率,故不建议用刚刚感染的细胞进行自噬诱导。一般感染后4天,荧光标记蛋白表达较稳定,细胞状态稳定,可以安排后续自噬诱导
Q
自噬慢病毒已经占据绿色荧光及红色荧
光两个通道,细胞核染色后也会占据蓝
色通道,如果想进行基因调控是否可以
再带其他颜色的荧光呢?
A:一般做自噬流检测我们不建议细胞再带其他颜色的荧光,例如是做基因敲减,有三种解决方案:
1)建议将目的基因shRNA构建在自噬载体上(该载体已经带有红绿荧光),那么进行自噬慢病毒感染即可,该方案的优点是只感染一次病毒,操作简便,缺点是重新构建载体可能会导致更高的成本;
2)选择其他的方式(如真核抗性筛选)建立好目的基因敲减稳定株后,再进行自噬慢病毒的感染,由于LC3自噬慢病毒本身带有嘌呤霉素puromycin抗性,因此建议选择其他真核抗性,如新霉素或潮霉素抗性等,这种方案将需要进行两次慢病毒感染(一次对基因调控建立稳定株,第二次感染LC3自噬慢病毒监测自噬流);
3)选择其他颜色的荧光,如青色荧光,由于很多荧光都是由绿色和红色为基础衍生而来,并且激发光与发射光直接的重叠也可能会发生影响,后续荧光颜色太多,也可能造成相互的干扰,因此存在一定的风险,下面小编列举了常见荧光的激发光以及发射光波长,给大家参考,选择技巧是尽量保证激发波长直接的距离远一些、不要有重叠,同时,第一种荧光的发射波长不会达到第二种荧光的激发波长:
荧光蛋白名称 | 激发波长 (nm) | 发射波长 (nm) | 光量子 | 结构 | 相对亮度 (EGFP的百分比) |
GFP (wt) | 395/475 | 509 | 0.77 | 单体 | 48 |
绿色荧光蛋白 | |||||
EGFP | 484 | 507 | 0.6 | 单体 | 100 |
Emerald | 487 | 509 | 0.68 | 单体 | 116 |
Superfolder GFP | 485 | 510 | 0.65 | 单体 | 160 |
Azam Green | 492 | 505 | 0.74 | 单体 | 121 |
mWasabi | 493 | 509 | 0.8 | 单体 | 167 |
TagGFP | 482 | 505 | 0.59 | 单体 | 110 |
TurboGFPGFP | 482 | 502 | 0.53 | 二聚体 | 102 |
AcGFP | 480 | 505 | 0.55 | 单体 | 82 |
ZsGreen | 493 | 505 | 0.91 | 四聚体 | 117 |
T-Sapphire | 399 | 511 | 0.6 | 单体 | 79 |
蓝色荧光蛋白 | |||||
EBFP | 383 | 445 | 0.31 | 单体 | 27 |
EBFP2 | 383 | 448 | 0.56 | 单体 | 53 |
Azurite | 384 | 450 | 0.55 | 单体 | 43 |
mTagBFP | 399 | 456 | 0.63 | 单体 | 98 |
青色荧光蛋白 | |||||
ECFP | 439 | 476 | 0.4 | 单体 | 39 |
mECFP | 433 | 475 | 0.4 | 单体 | 39 |
Cerulean | 433 | 475 | 0.62 | 单体 | 79 |
CyPet | 435 | 477 | 0.51 | 单体 | 53 |
AmCyan1 | 458 | 489 | 0.24 | 四聚体 | 31 |
Midori-Ishi Cyan | 472 | 495 | 0.9 | 二聚体 | 73 |
TagCFP | 458 | 480 | 0.57 | 单体 | 63 |
mTFP1 (Teal) | 462 | 492 | 0.85 | 单体 | 162 |
黄色荧光蛋白 | |||||
EYFP | 514 | 527 | 0.61 | 单体 | 151 |
Topaz | 514 | 527 | 0.6 | 单体 | 169 |
Venus | 515 | 528 | 0.57 | 单体 | 156 |
mCitrine | 516 | 529 | 0.76 | 单体 | 174 |
YPet | 517 | 530 | 0.77 | 单体 | 238 |
TagYFP | 508 | 524 | 0.6 | 单体 | 118 |
PhiYFP | 525 | 537 | 0.39 | 单体 | 144 |
ZsYellow1 | 529 | 539 | 0.42 | 四聚体 | 25 |
mBanana | 540 | 553 | 0-7 | 单体 | 13 |
橙色荧光蛋白 | |||||
Kusabira Orange | 548 | 559 | 0.6 | 单体 | 92 |
Kusabira Orange2 | 551 | 565 | 0.62 | 单体 | 118 |
mOrange | 548 | 562 | 0.69 | 单体 | 146 |
mOrange2 | 549 | 565 | 0.6 | 单体 | 104 |
dTomato | 554 | 581 | 0.69 | 二聚体 | 142 |
dTomato-Tandem | 554 | 581 | 0.69 | 单体 | 283 |
TagRFP | 555 | 584 | 0.48 | 单体 | 142 |
TagRFP-T | 555 | 584 | 0.41 | 单体 | 99 |
DsRed | 558 | 583 | 0.79 | 四聚体 | 176 |
DsRed2 | 563 | 582 | 0.55 | 四聚体 | 72 |
DsRed-Express (T1) | 555 | 584 | 0.51 | 四聚体 | 58 |
DsRed-Monomer | 556 | 586 | 0.1 | 单体 | 10 |
mTangerine | 568 | 585 | 0.3 | 单体 | 34 |
红色荧光蛋白 | |||||
mRuby | 558 | 605 | 0.35 | 单体 | 117 |
mApple | 568 | 592 | 0.49 | 单体 | 109 |
mStrawberry | 574 | 596 | 0.29 | 单体 | 78 |
AsRed2 | 576 | 592 | 0.05 | 四聚体 | 8 |
mRFP1 | 584 | 607 | 0.25 | 单体 | 37 |
JRed | 584 | 610 | 0.2 | 二聚体 | 26 |
mCherry | 587 | 610 | 0.22 | 单体 | 47 |
HcRed1 | 588 | 618 | 0.015 | 二聚体 | 1 |
mRaspberry | 598 | 625 | 0.15 | 单体 | 38 |
dKeima-Tandem | 440 | 620 | 0.24 | 单体 | 21 |
HcRed-Tandem | 590 | 637 | 0.04 | 单体 | 19 |
mPlum | 590 | 649 | 0.1 | 单体 | 12 |
AQ143 | 595 | 655 | 0.04 | 四聚体 | 11 |
1.实验技术干货
2.蛋白质组学研究
3.腺病毒简介及应用
6.单细胞测序
8.悬浮细胞专用病毒
10.测序技术研究与应用
12.腺相关病毒选择/应用
13.表观遗传研究
14.文章解析
15.国自然课题设计思路解析
16.生物信息分析及工具
17.外泌体研究
18.肿瘤免疫研究
19.高分文章