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【应用分享】全自动固相萃取-液质法对猪肉中四环素的检测方法
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本应用参照GB/T 21317-2007，采用ASPE720全自动固相萃取仪结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）建立了猪肉中四环素的检测方法。样品经Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取，PolyPlus HLB-2小柱净化，Kinetex F5色谱柱分析，外标法进行定量。结果表明，当四环素类添加水平为10 μg/kg时，使用ASPE720全自动固相萃取仪净化，回收率均在75% ~ 100%，RSD小于15%，能够满足检测要求。
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1
ASPE720
全自动固相萃取仪
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2
前处理耗材
1、主要仪器设备
PerkinElmer QSight液相色谱串联质谱仪；
ASPE720全自动固相萃取仪。
2、试剂材料
甲醇、乙酸乙酯为色谱纯；
乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙酸铅为分析纯；
四环素类混合标准品：用水：乙腈 = 3:1的溶液稀释；
柠檬酸溶液：0.1 mol/L。称取21.01 g柠檬酸，用水溶解，定容至1000 mL。
磷酸氢二钠溶液：0.2 mol/L。称取28.41 g磷酸氢二钠用水溶解，定容至1000 mL。
Mcllvaine缓冲溶液：将1000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液混合。
Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：0.1 mol/L。称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠放入1625 mL Mcllvaine缓冲溶液中，使其溶解，混匀后调节pH至4.0 ± 0.05。
甲醇 + 水（1 + 19 ）溶液：取10 mL甲醇与190 mL水混合。
甲醇+乙酸乙酯（1 + 9）溶液：取20 mL甲醇与180 mL乙酸乙酯混合。
PolyPlus HLB-2小柱：150 mg / 6 mL，P/N：CSS0146。
1、样品提取
称取均质猪肉5 g，置于50 mL离心管内，分别用20 mL、15 mL、10 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液进行提取，每次涡旋混合1 min，冰水浴超声10 min三次，10℃，3000 r/min离心5 min，合并上清液，并定容至50 mL，混匀，10℃，5000 r/min离心10 min，移取10 mL上清液转移至固相萃取仪标配的上样管中待净化。
2、样品净化
将HLB-2小柱放置于全自动固相萃取仪的SPE柱支架上，再将标配收集管放置于收集架上，按照表2的指令设置方法，启动仪器，由仪器自动完成净化步骤。
注：淋洗指令后的常规样品指令目的为吹干SPE小柱。
3、后处理
将洗脱液于35℃下用氮气浓缩至干，用1 mL初始流动相定容，涡旋震荡1 min，过0.22 μm Nylon滤膜，LC-MS/MS待测。
色谱柱：Kinetex F5，2.6 µm，3.0 × 50 mm ；
流动相A：2 mM醋酸铵（含0.1%甲酸）；
流动相B：甲醇；
柱 温：35℃；
进样量：5 µL；
梯度洗脱见下表。
离子源：ESI+；雾化气温度：220℃；电喷雾电压：4800 V；离子源温度：300℃；反吹气温度：100℃；质谱接口温度：250℃；采集方式：多反应监测（MRM）。
注：本实验中所有标准物质都以第一组离子对作为定量离子对。
图 1. 10 ng/mL四环素类混合标准工作溶液色谱图
图 2. 10 ng/mL四环素类基质混合标准工作溶液色谱图
图 3. 猪肉基质空白色谱图
图4. 10 μg/kg猪肉基质加标色谱图
本实验采用ASPE720全自动固相萃取仪建立了猪肉中四环素类的前处理方法，并结合LC-MS/MS对猪肉中四环素类的含量进行了测定。对于加标量为10 μg/kg的猪肉样品，回收率在75% ~ 100%之间，RSD小于15%，符合实验要求，且方法稳定，说明ASPE720全自动固相萃取仪适用于此实验操作。
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