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ProteinSimple

2022.7.12

于晓洁

博士研究生

北京大学

邓宏魁课题组

在本研究的初期，我们使用传统Western Blot技术进行转录因子的检测，但是由于我们研究的转录因子定位于细胞核且丰度不高，如果提取总蛋白就会大大削弱目标蛋白的水平，而传统WB往往对于蛋白的需求量较高，导致我们检测不到样本中的转录因子表达，浪费了许多时间和金钱成本。后来，偶然间得知北京大学国家蛋白质中心平台有一台ProteinSimple的全自动Digital WB，可以实现微量蛋白的检测，因此我们开始尝试使用Wes来检测我们的目标转录因子。

Wang, Yuting et al. Unveiling E2F4, TEAD1 and AP-1 as regulatory transcription factors of the replicative senescence program by multi-omics analysis. Protein & Cell (IF: 14.87), 2022.

细胞衰老，影响多种生理和病理过程，对整个机体衰老尤为重要。目前研究领域中发现一些转录因子能够影响衰老表征，但是仍缺乏通过多组学系统性分析传代衰老过程的表观变化。因此，本研究通过分析传代衰老过程中细胞转录组、甲基化组以及染色体可及性的时序性变化过程，发现炎症信号的上调以及增殖能力的下降是传代衰老过程的主要特征。进一步整合分析以及利用遗传学手段，我们发现转录因子E2F4、TEAD1和AP1是传代衰老过程重要的调控转录因子。过表达E2F4能够提高衰老细胞的增殖潜力，改善细胞衰老β-半乳糖苷酶活性并且改变衰老相关的甲基化位点。敲低TEA D1同样能够改善细胞衰老β-半乳糖苷酶活性并且改变部分衰老的转录谱学特征。另外，敲低ATF3，作为AP1家族转录因子的核心成员，能够降低衰老细胞cdkn2a(p16)的基因表达。综上所述，本研究结果通过多组学分析确定了调控衰老程序的转录因子，为抗衰老提供了潜在的治疗靶点。

在本研究中，我们使用了ProteinSimple的全自动Digital Western Blot（也称Simple Western）进行蛋白免疫印迹实验。本研究中利用Wes（Digital WB型号之一）对过表达及敲低的基因进行蛋白水平的检测，由于转录因子是需要表达出蛋白发挥作用，因此通过遗传学手段操控转录因子除了检测mRNA水平，蛋白水平的检测也是必不可少。通过Wes检测，可以清楚的说明我们确实过表达及敲低了目标转录因子，从而验证了我们的假设。

在本研究的初期，我们使用传统Western Blot技术进行转录因子的检测，但是由于我们研究的转录因子定位于细胞核且丰度不高，如果提取总蛋白就会大大削弱目标蛋白的水平，而传统WB往往对于蛋白的需求量较高，导致我们检测不到样本中的转录因子表达，浪费了许多时间和金钱成本。

后来我们也尝试了分离提取核蛋白，但是可能是由于提取过程的损耗，得到的核蛋白量也很低，达不到传统WB的需求量（10-15ug以上），因此在前期也是绕了很多弯路。后来，偶然间得知北京大学国家蛋白质中心平台有一台ProteinSimple的全自动Digital WB，可以实现微量蛋白的检测，因此我们开始尝试使用Wes来检测我们的目标转录因子。在技术支持的帮助下，我们在仅使用总蛋白（即无需提纯核蛋白）的基础上检测到了目标转录因子，也清晰展现出了我们想要的结果，即过表达或者敲低目标转录因子对应的表达量升高或降低。在这里，也非常感谢北大国家蛋白质中心平台提供了ProteinSimple的Digital WB仪器，为我们解决了研究过程遇到的难题。