加州大学伯克利分校首次开发供体PeT (d-PeT) 型电压敏感荧光染料(VF)

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加州大学伯克利分校首次开发供体PeT (d-PeT) 型电压敏感荧光染料(VF) | 前沿用户报道

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2022.8.11

近期，加州大学伯克利分校的 Evan W. Miller 教授课题组通过引入吸电子分子导线来反转电子流动的方向，首次开发了供体 PeT ( d-PeT ) 型电压敏感荧光染料(VF)。在该设计中，含有吸电子基团的VF染料具有电压敏感荧光特性，但是和受体PET ( a-PE T) 型电压敏感荧光染料的极性是相反的，在超极化生物膜电位状态下会增强荧光。

实验背景

基于光诱导电子转移( Pe T)原理的传感器通常是依赖于 PeT 进入激发态(受体PeT)或脱离激发态(供体 PeT )进行信号传输的。近期，加州大学伯克利分校的 Evan W. Miller 教授课题组通过引入吸电子分子导线来反转电子流动的方向，首次开发了供体 PeT (d-PeT) 型电压敏感荧光染料( VF )。在该设计中，含有吸电子基团的VF染料具有电压敏感荧光特性，但是和受体 PET ( a-PET ) 型电压敏感荧光染料的极性是相反的，在超极化生物膜电位状态下会增强荧光。相关成果以 “Flipping the Switch: Reverse-Demand Voltage-Sensitive Fluorophores”为题发表于J. Am. Chem. Soc. (DOI: 10.1021/jacs.2c05385)。

生物膜电位(V_m)源于选择性渗透脂质双层中离子浓度的差异，是生命的决定性特征。使用荧光指示剂可视化细胞V_m为传统电极方法提供了强大的补充，并力求解决与电生理学相关的低通量、空间分辨率差和侵入性问题。荧光染料长期以来一直用于监测生物学相关的分析物、反应和性质。光诱导电子转移( PeT )的调控是设计荧光报告分子的有效方法，是通过基于与分析物（如离子和反应性代谢物）的结合或反应控制 PeT 进入或退出荧光团的激发态。

作者在前期研究中一直在探索基于PeT的传感器来监控 V_m。他们假设电压敏感荧光团内的电压敏感性来自于对 V_m敏感的电子转移，因此电子转移的方向很重要。在超极化 V_m下，当电子从质膜中的分子导线移动到细胞外表面的荧光团中时，会发生PeT，染料的发光得到淬灭；而在去极化的 V_m下，电压降低了 PeT 的速率，染料的荧光得到增强。与这一假设一致，电压敏感荧光染料( VF )在膜去极化时具有荧光开启响应、纳秒响应动力学和电压依赖性荧光寿命。

当前，所有 VF 染料都是使用含苯胺的分子导线在受体 PeT (a-PeT) 结构中实现电压敏感性，其中荧光团充当电子受体。然而，如果关于电压传感机制的假设是正确的，用吸电子基团( EWG )代替富电子苯胺应该会降低导线的前沿分子轨道能量并实现供体激发的 PeT ( d-PeT )。在这种结构中，超极化的 V_m会降低PeT的速率，因而导致超极化电位下的荧光增亮（图1）。基于此，作者计算了一系列含有 EWG 取代基的分子导线的 HOMO/LUMO 能量，合成了 5 种新的 EWG-VF 染料，表征了它们的光谱特性，并评估了它们在哺乳动物细胞中的电压敏感性。其中，两种新染料显示出电压敏感性，但相对于先前报道的含苯胺的VF 染料极性相反（图2）。

图 1. 电压敏感荧光团中的 PeT 过程（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

图 2. 含 EWG 的 VF 染料的合成（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

实验过程

首先，为了研究通过 d-PeT 反转 VF 染料极性的可能性，作者进行了密度泛函理论( DFT )计算以预测正交荧光团和分子导线体系中的相对 HOMO/LUMO 能量（图3）。对于像4-NO₂-VF这样的 EWG-VF 染料，作者发现 4-NO₂-VF 的导线 LUMO 比荧光素 LUMO 低 -0.58 eV，表明可能存在 d-PeT 。同时，作者计算了包含其他 EWG 的分子导线的轨道能量。其中， 4-NO₂-VF 和 2,4-diNO₂-VF 都具有大约 -0.6 eV 或更大的 LUMO−LUMO (L−L) 间隙。基于此，作者认为用 4-NO₂和 2,4-diNO₂等强 EWG 取代可能会生成 d-PeT VF 染料。

图 3. 密度泛函理论( DFT )计算（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了验证 VF 染料可以“反向运行”的假设，作者合成了 5 种不同的EWG取代的二苯乙烯衍生物。由于具有相同的荧光团，所有EWG-VF染料的最大吸收均位于 511 nm处，最大荧光发射位于 527 nm （图4），而染料的荧光量子产率范围为 0.09-0.71。其中，4-NO₂-VF 和 2,4-diNO₂-VF 都具有低荧光量子产率，表明了高度的 PeT 淬灭效应。而且，在高浓度硫醇（2 mM谷胱甘肽）的存在情况下，EWG-VFs 表现出优异的稳定性。

图 4. VF 染料的光谱性质（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

接着，实验表明所有 EWG-VF 染料都可染色 HEK293T 细胞的质膜（图5），4-NO2-VF 的膜染色最亮。然后，作者使用全细胞膜片钳电生理学评估了 HEK293T 细胞中新型 EWG-VF 染料的电压敏感性（图6）。结果显示，具有 4-NO2 取代基的 EWG-VF 染料表现出电压敏感性，但极性相反，4-NO2-VF 和 2,4-diNO2-VF 的荧光在去极化时降低，在超极化时变得更亮。但是，2,4-diNO2-VF 在细胞中显示出非常弱的荧光，比 4-NO2-VF 低约 40 倍，因此作者利用4-NO2-VF进一步监测了大鼠海马神经元中的诱发动作电位(AP)。在单次试验中，4-NO2-VF 报告的 AP 平均 ΔF/F 为 -1.3%±0.14 ，信噪比(SNR)为 9.1±1.0 。对神经元AP 去极化的反应是荧光降低，表明 d-PeT 指示剂能够在复杂的细胞环境中起作用。

图 5. 细胞成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

图 6. 含EWG的VF染料在活细胞中的电压敏感性（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

接着，在比 -100 mV 更负的超极化电位下，4-NO2-VF 变得更亮，实现了 +2.4% 的超极化开启响应。在极端超极化电位下，光学响应偏离 -100 和 +100 mV 之间观察到的线性。超极化电位在抑制性神经传递中发挥重要作用，更广泛地说，在线粒体的生理学中发挥重要作用，其中静息线粒体电位在 -100 -200 mV 的范围内。最后，作者证明了 4-NO2-VF 可用于Vm 动态的双色映射，表明d-PeT方法能够提供快速响应动力学并且与双色成像兼容（图 7）。

图 7. 4-NO2-VF 在超极化电位下的电压敏感性（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结

加州大学伯克利分校的 Evan W. Miller 教授课题组报道了基于 d-PeT 的电压敏感荧光染料的设计、合成和验证。在该工作中，作者合成了 5 种不同的吸电子基团取代的荧光染料，表征了它们的光谱特性，并评估了它们在哺乳动物细胞中的电压敏感性。其中 4-NO2-VF 和 2,4-diNO2-VF 都是电压敏感的，可作为超极化的开启指示器。而且，4-NO2-VF 被成功应用于活细胞中，在超极化生物膜电位状态下显示出增强的荧光信号。

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