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项目文章 | 迈维代谢RNA修饰检测助力病毒感染分子机制研究
N4-乙酰胞苷调节肠道病毒71型的复制和致病性
●发表期刊：Nucleic Acids Research
●影响因子：19.160
●发表时间：2022.08.16
●发表单位：深圳大学
2022年8月16日，深圳大学生命与海洋科学学院胡章立教授团队与中国科学院武汉病毒研究所关武祥团队、深圳市南山区疾病预防控制中心袁建辉团队等共同在国际顶级期刊《Nucleicacids research》（影响因子：19.160）上发表题为“N4-acetylcytidine regulates the replication and pathogenicity of enterovirus 71”的研究论文。该研究揭示了ac4C调控病毒感染的分子机制，同时为RNA病毒的防治提供了新的思路和可能的药物靶标。迈维代谢为本次研究提供了RNA修饰检测服务。
化学修饰在RNA代谢和功能中发挥重要作用，是表观遗传研究领域的热点。N4-乙酰胞苷（ac4C）是真核生物mRNA中唯一已知的乙酰化修饰，具有促进mRNA的翻译和稳定性的功能。尽管在RNA病毒的基因组中发现了ac4C的存在，但ac4C调控病毒复制的具体分子机制还不清楚。研究发现EV71基因组5''非翻译区中内部核糖体进入位点（IRES）存在ac4C修饰，且此修饰由宿主乙酰转移酶NAT10催化产生。抑制NAT10或突变ac4C位点均抑制EV71复制，说明ac4C在病毒感染中的重要功能。随后，研究证实ac4C通过增强IRES与PCBP2蛋白的结合增强病毒RNA翻译并提高RNA的稳定性，也可增加EV71RNA与病毒RNA依赖的RNA聚合酶的结合。此外，ac4C位点突变减弱EV71在小鼠中的致病性。该研究不仅揭示了ac4C调控病毒感染的分子机制，同时为RNA病毒的防治提供了新的思路和可能的药物靶标。
1. EV71 RNA的5''UTR含有ac4C修饰，宿主乙酰转移酶NAT10的表达模式在感染期间发生了改变
为了研究EV71RNA是否含有ac4C修饰，从感染的培养物中大规模纯化病毒体RNA，并通过UPLC-MS/MS进行定量。EV71RNA中的ac4C残基占总胞苷的0.201%(图1a)，在EV71感染的Vero细胞的病毒体RNA和总RNA中检测到ac4C修饰，但在体外转录的EV71基因组RNA中未检测到ac4C修饰，用抗ac4C抗体的斑点印迹证实了这一点(图1b)用抗ac4C抗体进行acRIP，然后用EV71引物进行qRT-PCR分析，结果显示来自病毒感染细胞和病毒体的EV71RNAs都被拉低，而体外转录的病毒基因组没有被拉低(图1c)。这些结果表明EV71RNA含有ac4C修饰。为了绘制EV71基因组中的ac4C修饰状态，进行了acRIP-seq。在EV71基因组从核苷酸(nt)311到406的区域中鉴定出明显的ac4C峰，位于茎环IV(核苷酸242-445)5，UTR的IRES(图1d)，总之，证明了EV71RNA含有ac4C残基。
ac4C在EV71RNA上的去定位是由宿主乙酰转移酶NAT10介导的。在EV71存在的情况下，NAT10位于细胞核和细胞质中(图1k),并且细胞质中的NAT10与细胞核中的比率增加，EV71感染改变了NAT10的亚细胞定位，并且EV71感染可以增强NAT10的表达。
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图1 EV71含有ac4C修饰并改变了NAT10的表达模式
2. 5''UTR中的ac4C修饰促进了EV71的复制
为了研究ac4C是否影响EV71复制，Vero细胞中的NAT10被敲除,使用shRNA或被remodelin抑制，随后EV71感染。结果表明,重组蛋白减弱了病毒诱导的细胞病变效应,而NAT10促进了病毒复制。用WT和ac4C突变病毒感染Vero细胞，与NAT10敲除/抑制实验的结果一致，揭示了ac4C在EV71复制中起重要作用。由于EV71复制过程中存在正链和负链RNA，随后检测了NAT10对不同病毒RNA的影响，结果表明NAT10主要影响病毒正链RNA。
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图2 ac4C修饰促进EV71复制
3. ac4C修饰通过增强PCBP2与IRES的结合来促进RNA翻译
EV71RNA中的乙酰化位点位于IRES中的茎环IV(nt242-445 ),这对病毒蛋白质合成是至关重要的；ac4C修饰增强了EV71RNA的翻译效率。对ac4C影响蛋白质翻译的详细机制探究发现PCBP2和HNRNPK是可以结合茎环IV的ITAFs，PCBP2促进病毒RNA的翻译，而HN-RNPK对病毒蛋白质翻译不是必需的，ac4C通过选择性增强PCBP2与IRES的结合来促进病毒翻译。
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图3 ac4C增强了EV71RNA的翻译效率
4. ac4C修饰增强了EV71RNA的稳定性
mRNA的翻译和衰减有着错综复杂的联系。mRNA翻译的减少降低了mRNA的稳定性，这反过来降低了翻译.因此，我们对ac4C修饰是否与EV71RNA稳定性相关进行探索，ac4C修饰影响RNA降解效率，ac4C能够增强EV71RNA的稳定性。
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图4 ac4C增强了EV71RNA的稳定性
5. ac4C在体内体外促进EV71RNA与3D的结合
3D是EV71复制过程中直接结合并合成病毒RNA的关键蛋白。由于乙酰化促进了PCBP2与EV71RNA的结合，对ac4C是否影响3D与病毒RNA的结合进行评估。发现3D结合的EV71RNA通过重塑处理而减少(图5a)，ac4C修饰促进了EV71RNA与3D的结合。为了探索ac4C修饰是否在体外影响与病毒基因组的3D结合，结果表明，ac4C在体外增强3D结合，而且乙酰化位点的位置对结合能力很重要。
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图5 ac4C促进EV71RNA与3D的结合
6. EV71ac4C突变病毒对小鼠的致病性降低
IAV的甲基化修饰与疾病有关.因此，我们研究了乙酰化是否影响病毒的致病性。AG6干扰素受体缺陷小鼠感染EV71WT或Mut-331–350。感染ac4C突变病毒的小鼠表现出更长的存活时间(图6a)和减缓体重减轻(图6b)比感染WT病毒的多。在感染WT病毒的小鼠中观察到更严重的肢体瘫痪(图6c)。此外，qRT-PCR分析显示，在感染Mut-331–350病毒的小鼠的所有测试器官中，病毒RNA水平显著降低(图6d–f)。在Mut-331–350感染小鼠的四肢肌肉、大脑和肠道中观察到致病性降低(图6g和H)，导致肌纤维坏死减少(图6g)和神经元损伤(图6h)。肠细胞过度增生、肠绒毛上皮细胞溶解和绒毛顶端细胞空泡化减少(图6h)。此外，当使用抗VP1抗体时，IHC在Mut-331–350感染小鼠的小鼠、肠道和大脑中检测到较少的VP1(图6我)。总之，这些结果表明EV71ac4C突变减少了小鼠的病理损伤。
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图6 ac4C突变病毒对小鼠的致病性降低
本文结果表明ac4C在病毒感染中起关键作用，并证明EV71与宿主ac4C修饰系统相互作用来调节复制。ac4C通过促进RNA翻译、RNA稳定性和RNA与3D的结合来增强EV71的复制。此外，ac4C突变体在小鼠中表现出降低的致病性。然而，还需要更多的工作来阐明ac4C调节病毒RNA功能的分子机制，例如，确定参与调节病毒RNA稳定性的因子，以及评估ac4C对3D构象变化的影响。本次研究数据揭示了ac4C在RNA病毒在细胞质中复制的基本功能，并为EV71感染的预防和治疗提供了一个新的靶点。
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