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项目文章 | 代谢组助力中成药成分分析＆药效机理解析

迈维代谢

2022.8.25

结合代谢组学和网络药理学探究清热卡森颗粒治疗肾病综合征的作用机制

期刊：Frontiers in Pharmacology

IF: 5.810

发表时间：2021年12月

单位：湖北中医药大学

研究背景

2021年12月，湖北中医药大学李晶晶，韩林涛老师团队，一作段艳芬在Frontiers in Pharmacology发表了题为“Integrated metabolomics and network pharmacology to establish the action mechanism of qingrekasen granule for treating nephrotic syndrome”的研究论文。本研究综合代谢组学和网络药理学探讨了清热卡森颗粒治疗肾病综合征的作用机制。迈维代谢为本研究提供了次生代谢组检测分析服务。

肾病综合征（NS）是由肾小球通透性异常引起的临床综合征，主要表现为水肿和蛋白尿。清热卡森颗粒（QRKSG）是中国维吾尔族民间药物，是由菊苣（Cichorium intybus L.）制成的单味制剂，广泛用于治疗排尿困难和水肿。菊苣是QRKSG的主要成分，能够有效治疗水肿和保护肾脏。然而QRKSG中的活性成分及其治疗NS的潜在机制仍不清楚。

技术路线：

实验处理：对照组，模型组，治疗组（QRKSG组，贝那普利组）

实验样本：尿液以及血液（生理指标检测），肾脏（组织病理学观察，GC-MS检测），QRKSG颗粒（LC-MS/MS次生代谢物检测）

研究结果

血清生化指标和尿蛋白定量分析

与对照相比，模型组血清中TG、BUN、TC、Cr水平升高，ALB、TP下降，然而，QRKSG治疗后降低了血清中 TG、BUN、TC 和 Cr 的水平，ALB 和 TP 的水平升高（图1）。大鼠24 h尿蛋白评估显示，模型建立后第1-4周，尿蛋白逐渐增加（图2）。与模型组相比，QRKSG和贝那普利组在第1周的蛋白尿含量没有显著差异，但在第3、4周时，模型组的尿蛋白含量明显高于QRKSG组(p<0.001)。此外，在第4周，QRKSG组的尿蛋白水平高于贝那普利组。然而，与对照组相比，QRKSG和贝那普利组的尿蛋白水平降低。

图1 血清生化指标变化。(A) 血清Cr水平 (B)血清ALB水平 (C)血清BUN水平 (D)血清TG水平 (E)血清TC水平 (F)血清TP水平

图2 1-4周大鼠24h尿蛋白含量变化

组织病理学分析

作者利用光镜观察了肾组织病理变化，结果显示，对照组肾小球和肾小管结构正常，未见明显损伤。而模型组中肾小管异常、管腔扩张和水肿，与模型组相比，贝那普利和QRKSG组水肿及形态学改变明显减轻（图3）。透射电镜结果显示，正常组足突排列整齐，结构完整，基底膜厚度均匀。模型组足突有大量弥漫性融合，足细胞结构发生变化。此外，QRKSG和贝那普利组的融合程度显著降低，可见一些正常的足细胞（图 4）。组织学评估证实，QRKSG减轻了ADR诱导的NS对大鼠肾脏引起的病理损伤。

图3 各组组织病理学显微照片(×200)。(A)对照组；(B)模型组；(C)贝那普利组；(D) QRKSG组

图 4 电镜下各组肾小球足细胞改变(放大×8,000)。(A)对照组；(B)模型组；(C)贝那普利组；(D) QRKSG组

QRKSG 对肾脏代谢的影响

作者对对照组、模型组、贝那普利组、QRKSG组肾脏样品进行GC-MS分析，PCA结果显示，模型组和QRKSG组出现明显分离（图5C），PLS-DA R2 (=0.963) 和Q2 (=0.885) 表明该模型具有良好的判别和预测能力（图5D），肾代谢谱PCA和PLS-DA分析显示，QRKSG组和贝那普利组的代谢介于模型组和对照组之间，这些结果表明QRKSG治疗能够使大鼠肾脏代谢物水平恢复正常（图 5A、B）。

图 5 QRKSG对NS大鼠的干预作用。(A) PCA评分图；(B) PLS-DA评分图；(C)模型与QRKSG组的主成分分析；(D)模型与QRKSG组的PLS-DA分析；(E)大鼠肾脏24种潜在代谢物的热图可视化；(F)通路分析

代谢途径分析

24个代谢物被鉴定为QRKSG治疗NS中潜在的生物标志物（p1）。QRKSG组24个代谢产物中有15个上调，9个下调。热图结果显示，QRKSG和贝那普利组中代谢物发生了显著变化（图5E）。使用MetaboAnalyst5.0进行差异代谢途径分析，筛选影响值> 0.1作为潜在相关代谢途径。所鉴定出的潜在生物标志物主要涉及氨基酸代谢的四种途径：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢；以及精氨酸生物合成（图 5F）

QRKSG成分分析

作者使用UPLC-MS/MS进行的成分分析，总共鉴定出411种化合物，其中黄酮类化合物142个，酚酸类化合物149个，萜类化合物16个，生物碱类化合物29个，木酚素类化合物27个，香豆素类化合物3个，其他化合物45个。分析发现，QRKSG组中洋蓟素、槲皮素-4-O-葡萄糖醛酸、七叶苷和菊苣苷的含量最高。

表1 QRKSG中30种化合物的LC-MS/MS信息

网络药理学分析

作者综合SwissTargetPrediction 、GeneCards数据库获得相关靶标基因，利用DAVID 进行GO,KEGG富集分析。GO功能富集产生了2502个GO富集条目，包括 2,257（90.2%）个BP（生物过程）、75（3.3%）个 CC（细胞成分）和 170（6.8%）个 MF（分子功能），图中展示了富集前20的条目（图6A），KEGG富集前20的通路主要包括PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性（图6B），PI3K-Akt信号通路有35个靶点，包括AKT1、BCL2L1、mTOR、STAT3、EGFR和HSP90AA1。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路有22个靶点，包括CASP3、AKT1、TNF、MMP2和MAPK1。

图 6 富集前20的GO条目（A）和KEGG通路（B）

代谢组学和网络药理学分析

作者使用Cytoscape3.8.0构建代谢物-靶点-通路网络，结果显示34个节点相互作用（6个途径、5个代谢物、15个酶和8个靶点）（图7）。其中AKT1、BCL2L1和mTOR参与PI3K-Akt信号通路，对ADR诱导的足细胞肝损伤具有保护作用。凋亡相关蛋白CASP3、BCL2L1等也与肾小管细胞凋亡有关。因此，AKT1、BCL2L1、CASP3、mTOR是QRKSG治疗NS的核心靶点。此外，在网络图中，L-谷氨酸和鸟氨酸调节多个靶点，说明QRKSG通过多个靶点和代谢物调节多个代谢通路发挥治疗作用。

图 7 代谢物-靶点-通路网络

分子对接

作者首先对对接方法进行验证，AKT1、CASP3、BCL2L1 和 mTOR 的晶体分别含有原始配体，包括OR4 (AKT1)、TQ8 (CASP3)、H0Y (BCL2L1)和RAP (mTOR)。对接结果(图8B-E，蓝色配体)与实际结果几乎相同(图8B-E，红色配体)，对接和原始配体构象的均方根误差 (RMSD) 分别为 0.7740、1.6423、0.3114 和 0.5901。这些RMSD小于2.0 Å，表明对接可行、有效。本研究通过分子对接验证了QRKSG活性化合物显著调控AKT1、CASP3、BCL2L1和mTOR。结果表明，AKT1、CASP3和mTOR对大多数化合物有很强的亲和力，包括黄酮类化合物、萜类化合物和酚酸。化合物与靶标之间的绝对结合能值超过4.25 (图 8A），受力分析确定莴苣苦素通过5种氨基酸：ASN59、VAL-270、GLN-79、TRP-80、SER-205与AKT1结合(图8F)，通过3种氨基酸：ARG-139、PHE-105、TYR-101与BCL2L1结合（(图8G)）。对于CASP3，莴苣苦素通过6个氨基酸：THR-204、GLY-122、THR-166、HIS-121、MET-61、THR-62与AKT1结合(图10H)，而对于mTOR，通过5个氨基酸与之结合：GLU-2032、SER-2035、PHE-2108、TYR-2105、GLN-85(图8I)。

图 8 分子对接结果。（A）活性组分和目标之间的结合能；(B) AKTI对接的验证；(C) BCL2L1对接结果的验证；(D) CASP3对接结果的验证；(E) mTOR对接结果的验证；(F)莴苣苦素与AKT1形成的稳定复合物；(G) 莴苣苦素与BCL2L1形成的稳定复合物；(H) 莴苣苦素与CASP3形成的稳定复合物；(I) 莴苣苦素与mTOR形成的稳定复合物

蛋白质免疫印迹结果分析

作者通过分析p-PI3K、PI3K、p-AKT1、AKT1、p-mTOR、mTOR、BCL-2、CASP3蛋白表达，揭示QRKSG介导NS大鼠自噬和抑制凋亡的可能机制。结果显示，与对照组相比，模型中p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR和CASP3升高，而BCL-2降低（图9A）。与模型组比较，QRKSG中p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR、CASP3表达减少，BCL2L1表达增加（p<0.05）。与对照组相比，模型中p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR、CASP3表达明显升高，BCL-2表达明显降低（p<0.05）（图9B）。

图 9 PI3K、AKT1、mTOR、BCL-2和CASP3 Western blot分析。(A) PI3K，AKT1，mTOR，BCL-2，CASP3的代表性图像；(B) PI3K、AKT1和mTOR蛋白表达；(C) BCL-2和CASP3蛋白表达。

迈维小结

研究目的：探究清热卡森颗粒治疗肾病综合征的作用机制

研究结论：该文综合代谢组学和网络药理学探究了清热卡森颗粒治疗肾病综合征的作用机制，揭示了与5种代谢产物和6种途径有关的23个关键靶点。这些潜在靶点与多种QRKSG活性成分有关。在关键靶点中，AKT1、MTOR、CASP3 和 BCL2L1对QRKSG治疗NS的潜在机制很重要。具体而言，QRKSG的潜在机制包括抑制细胞凋亡、增加细胞自噬、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、减少蛋白尿和减轻肾脏损伤。因此，这些关于QRKSG潜在机制的发现为QRKSG临床应用提供了理论依据。