UPLC-分离的极致
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UPLC
分离的极致
01
色谱的核心
色谱的核心是分离,能够精准分离各个组分物质,UPLC相对于HPLC来说,将分离做到了极致。
UPLC具有高分离度(ultra resolution)、高速度(ultra speed)、高灵敏度(sensitivity)等优势。在全面提升HPLC的速度、灵敏度和分离度诸品质的同时,保留其原有的实用性及原理。
其最显著的优势是可以缩短分析时间,提高工作效率。
使用UPLC确实能明显缩短分析时间,提高效率(如某有关物质分析方法,使用HPLC运行一针是75分钟,UPLC完全可以在10分钟内搞定),分析效率提高将近7.5倍。
当然了,分析效率提高这么多,其配套设备肯定也不是闹着玩的。UPLC需要小颗粒杂化填料(1.7um)的色谱柱、更高耐压(达15000Psi)、低系统体积的输液单元。
02
溶液的制备很关键
样品的制备同样是过滤和离心两种方法。
过滤:根据样品溶液的极性,选择不同材质的0.22um滤膜过滤。
滤膜的选择,要进行分析方法确证,滤膜的相容性实验。
此处强调一下,必须是0.22um,千万不要用错。
离心:采用高速离心的方式(大于10000转/分钟)。
离心的方法一般适用于过滤较困难的溶液,为了保护UPLC的系统,离心完毕后建议再次进行过滤。
03
流动相的制备
所用有机相应是进口的色谱级别。使用的水应为超纯水,MILLI-Q纯水机生产的即可。
配制缓冲盐溶液应该有效期的规定,根据各实验室SOP规定。
UPLC系统使用的所有流动相均必须经过0.22um的微孔滤膜过滤
有关流动相,具体请查看以下文章:
流动相宝典2
解决流动相气泡问题
流动相宝典
04
色谱柱
色谱柱的使用,
一文搞定液相色谱柱
色谱柱使用宝典
色谱柱的报废要素:
1.色谱柱堵塞,压力升高1000psi。
2.色谱柱污染出现鬼峰、噪音增加、检测限增大时。
3.填料塌陷或污染引起色谱图前沿、拖尾、分叉时。
4.理论板数、分离度、拖尾因子按各检品质量标准规定执行,未规定的按各国药典通则规定执行,不符合上述规定时。
05
常见使用问题
液相基线噪音:
先停泵,若噪音消失,排查仪器问题,若噪音还存在,排查泵和流动相问题。
排查流动相问题时,需要重点考虑流动相的组成及检测波长是否发生了改变。一定要确定您所用仪器上最后使用的流动相是什么。
为了避免这个问题,在接上个人用仪器之前,要连接两通,用超纯水将仪器管路全部清洗一遍。
此外还需要考虑流动相的互溶性的问题。不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶,超出范围后就不互溶,使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时,还可能析出盐的晶体,尤其使用磷酸盐时需特别小心。
梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高,为了保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱,以辩证溶剂杂质峰。
分析弱酸性样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
流动相中加入有机胺可以减弱弱碱性样品和残余硅醇基的强相互作用,减轻或消除峰拖尾现象。所以在此使用的有机胺也成为减尾剂。
要确保所使用流动相不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩,从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
即使经过0.22um滤膜过滤,在保质期时间内,有的流动相仍会存在长菌、沉淀、结晶等现象。
流动相不干净,进入液相系统是非常危险的,尤其是缓冲盐。
在此有一个小窍门:用激光笔测试,不干净的缓冲盐溶液在激光笔照射时,里面会看到一条红线。
最后,还有滤膜的相容性问题,有的滤膜可以引起基线及噪音的波动,遇到这种情况,需要进行滤膜筛选。
液相基线波动案例分析
系统优化时所需过度溶剂:
1.反相和正相相互转换:
所用溶剂为异丙醇,原因:排除系统中空气的最好溶剂。
2.使用缓冲液后冲洗系统:
所用溶剂为二次蒸馏水,原因:再溶解缓冲液结晶的最好溶剂。
3.更换溶剂后:
所用溶剂为二次蒸馏水,原因:再溶解缓冲液结晶的最好溶剂。
泵的注意事项:
液相之泵维护
液相泵模块拆解
03
部件维保时间
基泰生物
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