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方法开发过程中如何提高分离度？
（图片来源：包图网）
上一期小编和大家分享了液相色谱柱使用过程中遇到分离度变差的情况要怎么排查（液相色谱中分离度变差该怎么办？），今天继续和大家分享在方法开发过程中该怎么提高分离度。
看下图公式，我们知道影响分离度（Rs）的因素有：柱效（N）、选择性（α）、容量因子（k）。
N：柱效（Efficiency）是指色谱柱的性能，柱效越高，分离度越好。在其他条件恒定的情况下，塔板数增加一倍，分离度提高40%。实际操作中，可通过以下两种方法增加塔板数，进而提高分离度：
第一，使用长柱或双柱串联，但也会使分离时间大大延长；
第二，使用小粒径填料的色谱柱，但需要耐更高压力的液相色谱系统，相比之下后者更为可取。
α：选择性（selectivity）是指色谱柱-流动相体系分离两个化合物的能力。选择性主要与固定相、流动相组成以及柱温等因素有关，与保留值也密切相关，其中固定相和流动相组成影响较大。
以最常见的反相模式为例，反相柱（包括C18、C8、Phenyl等）是以分配作用对化合物进行保留的，不同化合物的分离是基于它们在键合相与流动相中分配系数的差异，如果两种化合物的水溶性、在烷烃-水体系的分配系数等方面存在明显差异，那么这些化合物通常是能够利用反相柱达到分离；Phenyl柱对含苯环的化合物具有特殊保留。
正相模式下，硅胶柱、氨基柱、氰基柱与带有极性基团的化合物之间存在极性相互作用，对化合物的基团具有选择性，常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面，降低流动相的洗脱强度通常可以增大分离度；有机溶剂类型也会影响分离度，比如在反相条件下，乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异，这种差异需要在实践中摸索，但无论如何，多种溶剂类型增大了实现分离的可能性。
k：随着容量因子k的增大，分离度也随之增加，这种影响在k值较低时非常明显，当k值大于10时，k值增加对分离度的影响就不再显著，就是说一味提高k值以增大分离度是没有意义的。增加键合相密度能够提高k值；另外改变键合基团类型也能改变k值，比如在反相色谱中，随着键合相碳链长度的增加，k值逐渐增大。
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