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蛋白质组学的前世今生

迈维代谢

2022.9.22

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研究蛋白质组学的重要性

20世纪90年代，“人类基因组计划”吸引了全世界的目光，基因测序技术使人类探索生命奥秘、破译生命天书成为可能。当时的人们误以为“人类基因组计划”完成以后，人类生老病死的奥秘就会随之揭开，医学也将迎来极大的发展和进步。然而，随着人类基因组等大量生物体全基因组序列的破译和功能基因组研究的深入，科学家们发现，事情远没有想的那么简单：基因组学虽然在基因活性和疾病相关性方面提供了依据，但大部分疾病并不是基因改变引起的；并且，基因的表达方式错综复杂，同样的基因在不同条件下、不同时期内可能会起到完全不同的作用。关于这些问题，基因组学无法予以解答。

随着人类基因组测序的完成，众多“组学”如雨后春笋般蓬勃兴起。蛋白质组学、转录组学、代谢组学等应用而生，蛋白质组学作为其中最重要的研究领域之一，受到广泛关注。Nature、Science在2001年2月公布人类基因组草图的同时，发表了“And now for the proteome”和“Proteomics in genomeland”的评述与展望，将蛋白质组学的地位提到前所未有的高度，认为蛋白质组学将成为新世纪最大的战略资源——人类基因争夺战的战略制高点之一。当月，人类蛋白质组组织（Human Proteome Organization, HUPO）即宣告成立。次年，人类蛋白质组计划（Human Proteome Project,HPP）宣布启动。2002年首批启动了肝脏、血浆蛋白质组计划，之后又陆续启动脑、肾脏和尿液、心血管等器官/组织蛋白质组计划，以及数据分析标准化、抗体、生物标志物等支撑分计划。短短十几年间，蛋白质组学已经在细胞增殖、分化、肿瘤形成等方面进行了有力探索，涉及白血病、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肾癌和神经母细胞瘤等十余种重大疾病，发现了一篇新型诊断标志物、治疗性创新药物，为全面提高疾病预防诊治水平提供了重要基础，大力推动了“精准医学”这一新型医疗模式的发展。

蛋白质不仅是构成生物系统最重要的基本元件，而且是所有生命过程分工、整合、协同的最终执行分子。一个生物系统所表达或产生的全部蛋白质即为蛋白质组。蛋白质组学是指应用各种技术手段研究蛋白质组的一门新型学科，其目的是从整体的角度分析细胞或生物内蛋白质的组成成分、表达水平、修饰状态、相互作用及动态变化，并在此基础上揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的关系，进而获得在蛋白质水平上关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学是生命科学进入后基因组时代的必然产物和未来的重点研究方向。

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蛋白质组学的基本概念

蛋白质组（proteome）一词是澳大利亚科学家Williams和Wilkins于1995年首先提出的，它是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质总和，是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体，而不仅局限于一个或几个。由于同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同，因此，蛋白质组是一个动态的、变化着的整体[1,2]。而蛋白质组学是指利用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新学科。其主要目的是研究生物体内所有蛋白质的种类、表达水平、修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。人类蛋白质组织（HUPO）于2003年12月15日宣布国际人类蛋白质组计划（简称HPP）正式成立。HPP的目标是整合全世界尽可能多的实验室资源，使用现有的技术手段，穷尽人类所有蛋白质的种类，揭示蛋白质组在不同组织、不同器官、不同细胞等发挥的生理、病理功能。HPP主要分为biology/disease-HPP(B/D-HPP)和chromosome-HPP(C-HPP)，前者主要扩大我们对蛋白质组的生理功能、疾病发生相关的研究，后者主要目的是研究每条染色体上每个编码蛋白的基因所对应的蛋白质。可以这样认为，蛋白质组在生命科学中发挥着越来越重要的作用。科学家们预测，21世纪生命科学的重心将从基因组学转移到蛋白质组学，生命科学领域内一个全新的时代——蛋白质组时代即将到来。

蛋白质组学（英语：proteomics）是在90年代初期，由马克·威尔金斯(MarcWikins)和学者们首先提出的新名词，是从整体水平上研究细胞、组织、器官或生物体的蛋白质组成及其变化规律的科学，蛋白质组学研究将揭示细胞和生物体蛋白质的表达、修饰、相互作用及其动态变化，进而探索蛋白质功能与细胞生命活动规律的关系，获得单啊比值水平上关于细胞活动、疾病发生发展等活成的整体且全面的认识。蛋白质组学研究不仅能更加系统地揭示生命活动规律，而且能有效阐明疾病发生发展的内在分子机制和网络，并未最终攻克这些疾病提供理论依据和解决途径。例如，通过分析比较正常和疾病状态下的蛋白质组差异，可以找到某些“疾病特异性”的蛋白质，它们既可能成为新药设计的分子靶点，也会为疾病的早期诊断提供潜在的生物标志物。因此，蛋白质组学研究不仅将帮助人们从“系统论”的视角探索生命奥秘，而且能为人类健康尤其是“精准医疗”的发展提供直接的线索和重要手段。

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蛋白质组学诞生的历史背景

20世纪中期以来，以DNA双螺旋结构的发现为标志，生命科学的研究进入了分子时代。人们曾认为，物种或个体的全部遗传信息均蕴藏于基因组之中，完成对基因组的全面解读可以完整地阐释生命活动的分子基础。为此，20世纪90年代初，美国科学家率先提出并组织包括中国在内的多国科学家共同实施了人类基因组计划（HumanGenome Project,HCP）。该计划的目标是测定人类染色体（单倍体）所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。人类基因组计划是人类为了探索自身的奥秘所迈出的重要一步，是继曼哈顿计划和阿波罗登月计划之后，人类科学史上又一个伟大工程。2001年，人类基因组草图发表，被认为是人类基因组计划成功的里程碑[3]。然而，通过与酵母、果蝇、等基因组组图谱进行比较分析，人们发现，人类基因组的编码蛋白质数量竟然只是单细胞生物酵母的4倍，与果蝇等低等生物近似。

那么，究竟是什么因素决定了人类的物种特征和人体的复杂性呢？就在人类基因组计划完成的同时，科学家们就意识到单凭基因组很难回答这个问题。在这样的形势下，生物学研究的重点从揭示生物的遗传信息转移到整体水平上对生物功能的研究，生命科学进入后基因组时代，即功能基因组时代。人们尝试采用功能基因组学的技术策略如基因表达系列分析、RNA测序等对生物样本中的基因表达进行研究。然而，近年来许多针对多个物种的大规模蛋白质组分析均表明，mRNA与蛋白质丰度并未呈现过去人们所认知的较高相关性[4-6]。2016年发表在Cell杂志上的一篇综述文章对这些研究进行了系统总结，结果发现mRNA与蛋白质丰度之间的相关系数仅有不到0.4，即转录水平上的分析并不能完全反映蛋白质水平的表达[7]。另外，由于蛋白质存在大量及为复杂的翻译后加工修饰、转移定位、构象变化、蛋白质与蛋白质及蛋白质与其他生物大分子的相互作用，这些复杂的信息难以从DNA和mRNA水平获得，从而迫使人们转向直接研究基因功能的执行体——蛋白质的组成、表达和功能模式，进而揭示生命活动的基本规律。为此，国际著名学术期刊Nature和Science在发表人类基因组测序结果的同时，分别发表了Andnow for the proteome 和Proteomicsin genomeland两篇文章，标志着蛋白质组学时代的到来[8,9]。

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蛋白质组学的发展历程

4.1 蛋白质组学的技术起源

科学的发展依赖于技术的创新和突破，蛋白质组学也不例外。起源于20世纪50年代的Edman降解蛋白质测序技术（proteinsequencing）[10]，使得人们能够对纯化的蛋白质序列进行分析。采用该技术，科学家成功鉴定了许多重要蛋白质的序列，如血红蛋白、胰岛素等。然而，该技术分析通量低且耗时，人们继续寻求取代Edman降解的蛋白质/多肽鉴定技术。有趣的是，许多研究者的目光都集中在了质谱（massspectrometry,MS）技术上。然而，在20世纪80年代之前，蛋白质/多肽质谱分析面临的主要问题是如何将他们离子化，原因在于当时大多数质谱仪所配置的离子源均采用电子轰击离子化（electronionization,EI）模式。由于蛋白酶切多肽的极性通常很强，不具有挥发性，难以在EI条件下形成汽化的离子，故人们往往需要借助化学衍生的方式实现他们的氨基酸序列测定。尽管如此，基于EI-MS的衍生化多肽质谱分析仍存在许多缺陷，故许多的研究者们讲研究方向对准了离子化模式本身，期望通过直接李志华多肽或蛋白的方式实现他们的质谱检测。

20世纪80年代末，质谱分析领域中相继出现了两项里程碑式的重大突破，分别是机制辅助激光解析离子化（matrix-assistedlaser desorption/ionization., MALDI）和电喷雾离子化(electrospray,ESI)两种新型离子化模式。其中，MALDI技术最初被用来分析非挥发性的有机小分子，但在日本岛津公司田中耕一博士的努力下，首次实现了对生物大分子如蛋白质的直接检测[11]。ESI则是有耶鲁大学的约翰*芬恩（JohnFenn）教授首次提出的另外一种质谱离子化模式[11]，他可以将溶液中的分子直接转换为气态的离子，从而为之后液质联用技术的快速发展奠定基础。ESI的一项特殊之处是他能讲生物大分子转化为多电荷的离子，获取相对较低的质荷比，从而极大地提高了对大分子量蛋白的检测能力。鉴于田中耕一和博士和约翰·芬恩教授对生物大分子结构鉴定所做的杰出贡献,他们和发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构方法的瑞士科学家库尔特·维特里希（KurtWuthrich)共同分享了2002年的诺贝尔化学奖。MALDI和ESI技术的出现板大地提高了蛋白质/多肽的检测能力,伴随而来的问题则是如何通过对这些质谱数据的解读得到它们的氨基酸序列，由于20种天然氨基酸可以通过无数的排列组合拼接成一个蛋白质,因此仅仅依赖质谱数据本身仍难以实现对一个蛋白质或肽段的从头测序。

当时,人们往往只能将质谱技术用于一些已知蛋白质的验证分析。幸运的是,同样是在20世纪末,基因组学在创新测序技术的推动下也得到了快速的发展,许多简单物种的基因组被解析出来,这就使得人们能够更加有效地预测基因产物即蛋白质的序列,从面根据所预测的序列对已知或者未知蛋白质的质谱分析数据进行解读。在这个背景下,国际上许多课题组分别独立地提出了基于肽质量指纹图（peptidemassfingerprinting,PMF)的蛋白质整定策略，即首先将分离所得的蛋白质酶切为肽段混合物并进行质谱分析,通过寻找与基因编码的蛋白质数据库中某个序列的理论质荷比相符的离子实现蛋白质的鉴定[12,13]。结合高分辨的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术（two-dimensionalpolyacrylamide gel electrophoresis, 2-D PAGE）或者高效液相色谱分析技（highperformance liquid chromatography.HPLC)[14,15],PMF曾广泛应用于生物样品中的蛋白质鉴定分析。借助该技术,来自澳大利亚悉尼大学的Wilkins和Humphery-Smith教授等于1995年首次完成了对支原体中50个蛋白质的鉴定并提出了蛋白质组的概念[1]（见图1.1）

4.2 蛋白质组学技术的快速发展：从定性到定量

由于仅仅依赖于单一的多肽测定相对分子质量信息，PMF技术在多肽序列的数据库匹配中银阳性率往往较高，尤其是在使用低分辨质谱如离子阱或四级杆质量分析器的条件下。为了解决这些问题,1994年末,Yates和Mann课题组分别发展了两种类似的基于多肽二级质谱信息的蛋白质数据库鉴定搜索算法,极大地提升了蛋白质鉴定的效率和准确性。前者选择将二级质谱中所有的碎片离子信息代人基于蛋白质序列数据库的虚拟二级谱库中进行搜索[16]；后者则选择对二级质谱信息进行快速的从头测序,建立若干序列标签之后再代人类似的虚拟谱库中进行搜索[17]。

尽管这两种算法各有优缺点,但无疑前者的发展和应用更为广泛,并最终形成了后来广为人知的SEQUEST算法体系。尽管如此，当时所谓的蛋自质组学研究仍主要集中在对蛋白质复合物进行组成解析，鲜有关于细胞或组织完整蛋白质组的分析。究其原因，离线电泳或色谱分离在很大程度上限制了蛋白质组分析的通量。因此，人们发展了许多基于液质联用技术的蛋白质组分析方法，以期提高复杂体系中蛋白质鉴定的灵敏度和通量。例如，2001年。Yates课题组应用名为多维蛋白质鉴定技术（multidimensionalprotein identification technology,MudPIT）的在线二维色谱与质谱联用技术，首次在酵母细胞中鉴定到仅1500个蛋白质，实现了单个生物体蛋白质鉴定数目的飞跃[18]。

从此，蛋白质组学研究进入一个快速发展的阶段，各种新技术、新方法层出不穷。尤其是质谱技术的快速发展，如新型轨道阱质谱仪及数据依赖型采集模式的出现极大地提高了蛋白质组分析的灵敏度[19]，使得单次蛋白质组分析中鉴定获得的蛋白质组数目与日俱增。显而易见，采用传统手动解析的方法验证蛋白质鉴定结果准确性的方法变得不再可行。如何才能有效地保证大规模蛋白质组鉴定的准确性？针对该问题，Gygi课题组发展了一种基于反相蛋白质序列诱饵数据库错误发现率（falsediscovery rat,FDR）的评估方法，目前已经成为检验蛋白质组分析准确性的公认标准[20]。进入21世纪，蛋白质组学的研究逐步实现了从定性鉴定到定量分析的跨越（见图1.1）。其中代表性的技术包括Yates课题组开发的二级谱图计数法（spectracounting）[21]，Aebersold课题组开发的同位素编码亲和标签技术（isotope-codedaffinityag, ICAT）[22]，Mann课题组开发的细胞培养稳定同位素标记技术（stableisotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC）[23]以及由AppliedBiosystems公司开发的同位素标记相对和绝对定量技术（isobarictags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）[24]等。此外，一些在小分子化合物定量分析中广泛应用的技术如下图：

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图1 国际蛋白质组学发展历程大事记

基于一级谱信号强度的定量技术（MS1filtering）[25]以及多重反应监测（multiplereactionmonitoring,MRM）[26]也被成功移植到蛋白质组的定量分析汇总。在十多年的发展过程中，定量蛋白质组技术一直呈现出一种“百花齐放”的局面。近年来，新的技术和方法仍在不断涌现。例如，2012年底，Coon课题组和Domon课题组先后提出了平行反应监测模式（parallelreaction monitoring,PRM）[27]的概念，即利用高分辨串联质谱MS/MS谱中所有离子信号定量多肽及蛋白质；又如，Aebersold课题组于同年发展了一种基于数据非依赖型采集模式的定量蛋白质组技术SWATH技术[28]，该技术能够有效保留几乎所有肽段的质谱定性定量信息，特别适用于对一些痕量稀有生物样本蛋白质组进行数字化存储。

4.3 蛋白质组学逐步走向成熟

随着技术的进步，蛋白质组学的研究范畴也日益广泛，从最初的蛋白质定性与相对表达量分析逐步拓展到了蛋白质绝对丰度定量、蛋白质-蛋白质相互作用、翻译后修饰蛋白质的组织器官空间定位乃至亚细胞定位以及在特定生理病理条件下的蛋白质或修饰动态变化等方面。以蛋白质组（proteome）为关键词的PubMed检索结果显示，蛋白质组的研究论文在20年内增加了3个数量级(见图1.2)。蛋白质组学定性和定量技术方法也日趋成熟。如2011年，Mann和Aebersold团队分别同时报道了在Hea细胞中鉴定到9207个基因编码的10255个蛋白质和在U2OS细胞中鉴定到7716个基因编码的11548个蛋白质，成为人细胞蛋白质深度覆盖的标志[29,30]。

除了覆盖深度方面的进步，在分析速度方面也实现了较大的提升。由Qin和Qian的课题组合作开发的蛋白质组快速定性定量技术，首次将蛋白质组的深度覆盖速度由过去的3天时间缩短至12小时[31]。Coon课题组2014年报道了一项在1.3小时内鉴定近4000个母蛋白质的工作，基本上能够覆盖90%的酵母基因表达产物[32]。借助不断更新的质谱仪器和超高效色谱分离系统，目前许多专门从事蛋白质组学的实均能实现在8~12小时之内完成细胞或组织样品6000-800个蛋白质的鉴定[33]。此外，定量蛋白质组技术的精准度和可重复性也得到了较大的提升。例如,2014年Paulovich课题组联合来自美国西雅图、波士顿和韩国不同研究小组的研究人员，共同对乳腺癌细胞中319种蛋白质进行了基于MRM的定量蛋白质组分析[34]，结果显示不同实验室的测定结果具有很好的相关性，证明该方法可实现跨越实验室和国界的标准化，将有利于利用全球资源对所有人类蛋白质进行标准化定量设立一些新标准。

在上述技术背景下，蛋白质组学研究进入了全新的发展时期，一些突破性的研究结果相继公布。例如,2015年两个独立的研究小组在Nature杂志上同时发表了第一张人类蛋白质组草图[35,36]，他们通过基于质谱的蛋白质组技术对人体几十种不同类型组织或体液进行了分析，共获得非患病人体中近20000个基因编码的蛋白质产物，为更好地理解疾病状态下发生的机体变化奠定了基础。美国于2006年成立了名为临床蛋白质组肿瘤分析计划(ClinicalProteomic Tumor AnalysisConsortium，CPTAC)的肿瘤蛋白质组研究协作组，主要从事若干主要癌症的蛋白质组研究并于近年来取得了一系列重大进展。该协助组中主要成员Liebler课题组与Car课题组分别于2014年2016年在Nature杂志上报道了针对乳腺癌的大规模蛋白质基因组proteogenomics)研究结果，他们分别对癌症基因组计划(TheCancer Genome Atlas,TCGA)采集的近百个相应肿瘤组织进行蛋白质组分析，并与已有的基因组数据及临床信息进行比对和整合，为这些肿瘤的精准分型及肿瘤生物学研究提供了重要理论依据[37,38]。该协作组的另一篇对卵巢癌蛋白质基因组的研究结果也于2016年在Cell杂志上发表[39]。

值得注意的是，随着规模化蛋白质组学研究的迅速发展，质谱数据的产出速度也出现倍增的趋势，对蛋白质组数据的存储、共享及质量控制提出了更高的要求。为此，人们已经开发了多个蛋白质组学公共资源库，如PRIDE和肽计划(PeptideAtlas)等。以欧洲生物信息学研究所开发的PRIDE数据库(htp：//www.ebi.ac.uk/pride/)为例，其提供了一个关于蛋白质识别的开源数据库，允许研究者们存储、分享并比较他们的结果。这个免费使用的数据库旨在通过集合不同来源的蛋白质组数据，让研究者们能方便地检索已经发表的同行评议标准数据并且允许使用者运用这套标准来传递数据。

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图2 蛋白质组学文章发表年增长图

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