分享至
蛋白质组学专题 | 蛋白质组学样本前处理：提取方法选择
上一期我们介绍了常见的裂解液和细胞破碎方法（蛋白质组学专题 | 蛋白质组学技术主流方法原理介绍），今天我们再聊一聊针对不同的样本类型，如何选择合适的样本预处理方法。
常见的样本类型大致分为如下几类：细胞样品、动物组织样品、植物组织样品、石蜡包埋组织样品、细菌样品、血清类体液样品、IP类样本等等。每一类样本其前处理方法都略有区别，接下来，我们选择几类样本详细聊一下样本蛋白提取的问题：
细胞样本相对较容易处理，常见的处理方法也很多，包括加入裂解液直接冰上裂解、反复冻融法裂解、加入裂解液后超声处理、SDS高温煮沸提取等。
一般来说我们会选择加入裂解液后超声处理来提取细胞蛋白，其实验步骤与动物组织类似。此类方法通常情况下，我们要求细胞量需要达到106的数量级。当然，有一些新的技术方法，需要的细胞量会非常少，比如，现阶段我们常提到的微量样本蛋白质组学，能对10-1000个细胞进行蛋白质组学实验；随着蛋白质组学技术的发展，甚至能对一个细胞进行蛋白质组学分析，比如单细胞蛋白质组学等。
在这里我们提到的处理方法只适合比较常规的动物组织样本，包括心、肝、脾、肺、肾、肌、脑等组织；皮肤、毛发、骨组织等不在此列，需要利用特殊的处理方式。一般来讲，动物组织样本中是含有血液的，如果不去除，会在样本中引入血液高丰度蛋白，从而影响后续质谱鉴定。在前处理中，需要用PBS清洗组织样本，为避免在清洗过程中蛋白降解，一般要在冰上操作。有条件的实验室，最好在样本冻存之前完成清洗，可以避免后续清洗中的反复冻融造成的样本蛋白降解。
清洗完成后，采用液氮研磨或者匀浆的方式进行组织破碎，如果样本量比较多，则可以用组织研磨仪进行样本研磨。组织破碎之后，再加入裂解液，裂解液一般选择8M尿素裂解液或者RIPA裂解液。然后使用超声波，进一步辅助裂解。超声完成后，溶液一般呈透明状，如溶液比较浑浊，则是裂解液加入过少，裂解不充分导致。
裂解完成后，需要离心去除未裂解的组织成分和其他杂质，如结缔组织等，一般采用4℃15000g离心10min，然后吸取上清液。特别注意有些样品脂肪含量比较多，可以看到提取时上面有很大一层脂肪层，下面可能还会有未完全裂解的组织沉淀，此时，可以通过反复离心取上清液的方法来获取干净度更高的蛋白液样本。
对于植物组织样品，难点就在于细胞壁破碎及叶绿素的去除。由于植物细胞比动物细胞多了细胞壁，一般的匀浆根本搞不定细胞壁，没办法碎得充分，所以对于植物组织样本通常采用液氮研磨来破碎组织和细胞。
在样本组织研磨完成之后，我们会选用裂解能力较强的裂解液来进一步破碎植物组织细胞，来提取蛋白，常用到的裂解液是酚抽提试剂或SDS裂解液。由于植物样本纤维组织含量比较多，再加上植物细胞壁又比较厚，所以我们得用超声、震荡，以及各种方法组合，进行蛋白质的抽提。
在搞定植物组织样本蛋白提取之后，我们需要处理色素的问题了。植物色素是一类小分子有机物，如果在前处理中去除不干净，则会影响后续的蛋白定量，且在接下来的酶解除盐中，也比较难去除，最后造成很强的背景峰，干扰质谱检测，影响检测深度。一般色素通过丙酮或TCA沉淀来去除，首先利用丙酮或者TCA能够使蛋白沉淀，然后利用色素溶于丙酮的原理来清洗蛋白表面的色素。
最后，用8M尿素溶液来复溶沉淀后的蛋白，离心取上清就得到了蛋白溶液。
在植物样本中有几类比较特殊的样本类型，如，种子，果实。有些种子中含油量比较高，需要预先用其他方法去除油脂；有些种子糖类含量比较高，需要选择合适的裂解液；有些果实中含水量也非常高，蛋白得率比较少，提取时需要适当的加大样本量，或者将样本水分冻干后在提取蛋白。
注意：在使用酚抽提取蛋白是有一个小技巧，可以通过改变缓冲液中蔗糖浓度，来提取不同糖浓度的植物样本，也可以通过改变缓冲液中蔗糖浓度，来调整酚相和水相的位置。
体液类样本的种类比较多，在这里主要以血清为例来介绍血清样本的前处理方法。血清样本中含有大量的高丰度蛋白，前14种高丰度蛋白占血清总蛋白的95%以上。而质谱是一种离子饱和性检测器，低丰度离子的信号很容易被高丰度的抑制，从而无法检测到。
在以往的血清蛋白质组学实验中，常规方法是先用试剂盒除去血液中的高丰度蛋白，然后进行质谱检测。现在随着质谱仪的发展和前处理方法的革新，血液蛋白质组学大致可以分为二类：
第一类：不去除血液中的高丰度蛋白。直接对血液样本进行前处理，得到肽段，然后借助高性能质谱仪器和DIA数据采集模式进行蛋白质组学实验。这样做的好处是能减少了除高峰度对血清样本带来的干扰，一定程度上减小了实验误差；但是由于高丰度的影响，检测深度还是受到限制，目前timsTFO Pro2 质谱仪器在DIA数据采集模式下，单针大约能鉴定到800左右蛋白。
第二类：除去血液高峰度方法。市面上去除血液高丰度的试剂盒比较多，它们的原理大致可以分为两类：
1.不依赖抗体的方法，典型代表产品是Bio-Rad的Proteominer试剂盒。这类试剂盒可高特异性亲和样品中低丰度的蛋白质，而没有与结合位点结合的那些过量的高丰度蛋白质就会被去除。通过这个方法处理后，最终能鉴定到的蛋白也是比较多的，从鉴定的数量上看timsTOF Pro2质谱仪器在DIA数据采集模式下大约能鉴定1500左右蛋白。这种方法是非抗体型的，它不受物种限制和样品类型限制，重现性也比较好，而且成本较低。
2.依赖抗体的方法，现有的产品包括安捷伦的MARS柱、Thermo的Pierce Albumin/IgG的试剂盒、SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns。
这些产品都是基于特异性抗体除去血液中的高丰度蛋白，然后再进行质谱检测。通过此类方法处理后，能大大提高了蛋白质组学的鉴定深度，由于其特异性的去除血液中的高丰度蛋白，实验的稳定性和可重复性还是不错的，文章接受度也比较高，但是缺点是价格贵，成本高，且不便于保存。
除了上述的4种除高丰度试剂盒外，目前市场上还有一种磁珠法富集低丰度蛋白的试剂盒，通过测试，用timsTFOPro2质谱仪，DIA数据采集模式大约1小时能鉴定到3800左右蛋白，而且数据重复性和稳定性都很好，实验重复性能达到0.98以上（如下图所示）。利用该类试剂盒使血清蛋白质组学的鉴定深度上了一个台阶，为更好的寻找生物标志物打下了基础。而且，在成本上只约高于Bio-Rad的Proteominer试剂盒，笔者认为磁珠法富集血清低丰度蛋白试剂盒必将大放异彩。
通过各种方法把蛋白质提取出来以后，这事儿还没完，因为我们需要对提取出来的蛋白进行质控，以确认是否成功提取到足够的蛋白，蛋白质量是否符合标准等。一般质量控制分两个部分：
1.含量测定，测定提取的蛋白浓度和蛋白量，并根据提取蛋白量计算蛋白得率，评估蛋白提取效果。常用的蛋白定量方法有BCA和Bradford法，需要注意的是定量试剂的不兼容问题，如果样品中有SDS、Triton等去污剂，就不要用Bradford法来测定蛋白浓度，可以选用BCA方法；如果样品里加入了还原剂、EDTA浓度大于2mM以上，就不要用BCA方法来测定蛋白；如果同时含有去污剂和还原剂，则需要用丙酮对蛋白进行沉淀，重新用不含有上述物质的buffer复溶蛋白后再进行蛋白定量。
2.SDS-PAGE，一般我们会取等量蛋白样本进行SDS-PAGE，然后通过条带来评估提取蛋白的效果以及蛋白定量的准确性。在SDS-PAGE时我们会遇到一些情况，下表简单列举了几种以及一些应对措施。
讲到这里，基本上已经介绍完了蛋白质组学样本前处理过程中蛋白提取和质控的一些问题。总的来说，在样本蛋白提取的整个过程中涉及的样本类型比较复杂，遇到的问题可能也是各种各样，总结一下，大致有如下几个要素是我们需要注意和遵守的：
在保证蛋白提取效果的情况下，尽可能用简单的处理方法提取蛋白；
高丰度蛋白是质谱检测的头号大敌，在实验中要尽可能的减少引入高丰度蛋白的可能；
SDS等去污剂与后续质谱不兼容，提取蛋白时需要慎用，上质谱前必须去除；
提取出蛋白后需要妥善保管和保存蛋白液，尽量避免反复冻融导致的蛋白降解；
样本种类复杂，各类前处理方法需要灵活搭配使用。
好了，关于蛋白质组学样本前处理部分的蛋白提取部分就讲到这里，下期再来谈谈蛋白质组学样本前处理中的酶解和样本除盐的问题。
参考文献：
1、GebreyesusSofani Tafesse,Siyal Asad Ali,Kitata Reta Birhanu et al. Streamlinedsingle-cell proteomics by an integrated microfluidic chip anddata-independent acquisition mass spectrometry.[J] .Nat Commun, 2022,13: 37.
2、WangWei-Qing,Jensen Ole Nørregaard,Møller Ian Max et al. Evaluation ofsample preparation methods for mass spectrometry-based proteomicanalysis of barley leaves.[J] .Plant Methods, 2018, 14: 72.
3、SoniRajesh Kumar,High-Throughput Plasma Proteomic Profiling.[J] .MethodsMol Biol, 2022, 2546: 411-420.
4、ShehadulIslam M, Aryasomayajula A, Selvaganapathy PR. A Review on Macroscaleand Microscale Cell Lysis Methods. Micromachines (Basel). 2017 Mar8;8(3):83. doi: 10.3390/mi8030083. PMCID: PMC6190294.
（1）迈维4D蛋白质组学
●蛋白质检出数量多、样本检出稳定性高
●定性重复性高，更准确
●定量稳定性高，可重现性高
（2）迈维Olink蛋白质组学
近两年Olink蛋白质组频发高分文章，并凭借其超敏、微量、有利于中低丰度蛋白检出等优势，迅速火爆医学与临床研究领域。为提供创新的蛋白质组学服务，迈维代谢紧跟科研前沿，提供Olink蛋白质组学检测服务。
99%的代谢组学研究者都在阅读下文：
●生信小工具 | 手把手教你从序列查找开始，绘制漂亮的进化树
客服微信：metware888
咨询电话：027-62433042
邮箱：support@metware.cn
网址：www.metware.cn
我就知道你“在看”
