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流式细胞术应用之——DNA倍体分析
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析的技术，FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面。在生物科学研究中可以使用流式细胞术测定细胞周期、DNA 含量，检测细胞凋亡，进行倍性、染色体核型和流式分子表型分析等。在医学研究及临床实践的应用中流式细胞术也发挥了重要的作用，例如肿瘤诊断和分型、血液病的诊断和治疗以及免疫相关疾病分析等方面的应用。
20世纪70年代以来， 流式细胞术逐渐应用于肿瘤细胞 DNA 倍体及 S 期指数分析，通过测定 DNA的含量,了解肿瘤细胞中染色体异常及细胞增殖活性情况,并将DNA异倍体作为恶性肿瘤的标志之一。用流式细胞仪分析大量细胞的细胞周期和 DNA 倍体已经成为一种日益重要的肿瘤研究方法并广泛应用于肿瘤基础和临床研究中，为肿瘤的诊断、疗效、评价和预后预测提供了重要的参考指标。
细胞周期与DNA含量的周期性变化
健康人静止期细胞有23对染色体,称之为二倍体细胞。而正常的增殖细胞 其DNA 含量则不同。在细胞周期（G0、G1、S、G2、M）的各个阶段DNA 的含量随各阶段呈现出周期性的变化：在 G1期细胞开始 RNA 和蛋白质的合成，但 DNA 含量仍保持二倍体；进入 S 期后DNA 开始合成，这时细胞核内DNA 的含量介于 G1和 G2期之间；当 DNA 复制结束成为四倍体时，细胞进入 G2期，G2期细胞继续合成 RNA 和蛋白质直到进入 M 期。因此单纯从 DNA 含量无法区分 G2期和 M 期。而 G0期从 DNA 含量 上同样无法与 G1期区分，因此整个复制周期可以描述为 G0／G1、S、G2／M期。通过流式细胞仪进行分析，可以得到细胞周期各个阶段 DNA的分布状态,计 算 出 G0／G1％、S％、 G2／M％从而了解细胞的增殖能力。
图a：PI标记法检测细胞周期流式图 图b: 肿瘤组织细胞DNA直方图
图一选自 陈朱波，曹雪涛.《流式细胞术—原理操作及应用》第二版—158页
图二选自 王书奎，周振英.《实用流式细胞术彩色图谱》—第34页
DNA倍体分析中的重要参数
在进行DNA倍体分析时，会用到一些重要的参数，其中包括DNA指数DI,增值指数PI,以及S期细胞比率SPF。其中DI指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均道数与人正常二倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值，表示DNA的相对含量，DI为1意味着二倍体(2c)(一般正常范围为0.9~1.1)。SFP和PI均表示细胞的增殖活性。当细胞增殖活跃,或细胞阻滞在S期，G2期时，S期或G2期的细胞相对较多，其对应的SFP或PI值会增高。
异倍体的判断标准
参考1984年国际分析细胞学会名词审定委员会作出的对FCM检测DNA非整倍体的建 议以及1992年美国国立癌症所组织的FCM⁃DNA倍体分析统一标准的国际会议的决定，以 DI 值为依据对肿瘤组织的 DNA 倍体数进行分类。DNA 异倍体判定标准为：DNA 直方图上出现明 显的 2 个峰，且异倍体细胞群至少包含 5%~10%的细胞数；DI值在0.90~1.10之间为二倍体，0.85~1.15 之间为近二倍体，1.90~2.10之间为四倍体，>2.10为多倍体，其他DI值为非整倍体；异倍体包括近二倍体、四倍体，多倍体及非整倍体。
DNA倍体分析的临床应用
DNA 倍体检测在肿瘤早期诊断和预后判断中应用广泛。在肿瘤早期诊断及鉴别中，DNA 异倍体的出现是癌变的一个重要标志，有助于癌变的早期诊断以及选择适合的治疗方法；淋巴瘤在病理学不能作出诊断前，DNA 倍体分析可为其提供准确的诊断信息；形态学表现为良性的肿瘤，出现 DNA 非整倍体，提示可能有恶变的可能，DI 值可判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标。DNA 含量和 DNA 倍体在预后判断中，通常认为非整倍体的肿瘤恶性程度高，预后差；二倍体或者接近二倍体预后好；反应肿瘤增殖状态的 S 期比例也作为判断预后的指标。
总之，通过FCM检测DNA异倍体含量可发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断；为良恶性肿瘤的临床判别，治疗疗效及预后判断提供有效依据，提高诊断准确性，可作为临床诊断重要手段推广应用。
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