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小融科普丨细致解读糖化血红蛋白检测方法

融智生物

2022.11.18

HbA1c（糖化血红蛋白）是血红蛋白β链末端的缬氨酸残基与血液中的己糖(主要指葡萄糖)通过一个缓慢的不可逆的非酶促反应形成的一种糖蛋白，能够反映血红细胞整个生命周期8～12周内血浆葡萄糖的平均水平。

血红蛋白结构

1976年，糖化血红蛋白首度被提出作为监测糖尿病患者糖代谢控制程度的标准。2010 年，美国糖尿病协会（ADA）首次将糖化血红蛋白纳入糖尿病诊断标准。临床上HbA1c的检测有助于患者和医生了解特定的糖尿病治疗是否有效及是否需要对治疗方案进行调整。

HbA1c的临床意义

根据《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》，HbA1c≥6.5%可以作为糖尿病诊断的参考标准之一。指南指出，我国的2型糖尿病患病率11.2%，知晓率仅36.5%，较低的知晓率与大规模诊断筛查的缺少直接相关。

由于数值波动小、检测方便等特点，糖化血红蛋白检测非常适合作为糖尿病的筛查方式。现阶段我国约有8000万糖尿病待筛查人群，庞大的需求和严峻的事实表明推动基于糖化血红蛋白筛查为基础的血糖浓度的长期稳定性筛查刻不容缓。

《中国2型糖尿病防治指南（2020年）》糖尿病诊断标准

现有的HbA1c检测方法学及特点

目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两大类：一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同，如离子层析法、电泳等方法；另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点，如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。我国对HbA1c检测标准化日益重视，但由于方法的不同所测出的数值及代表单位在不同的应用中存在差异。此外，HbA1c检测中不同方法学间的精密度和准确性也对测定结果的统一性造成一定的影响。因此需要不断提高HbA1c的检测质量，以适应其在临床应用发展中的需要越来越受到临床检验的关注。

基于电荷差异的分离方法

血红蛋白HbA1c和HbA0在等电点上具有细微的差异，这意味着在给定的分析情况下，会使两者具有不同的电荷，在此基础上可以将其进行分离。这是使用离子交换色谱、电泳、毛细管电泳和等电点聚焦方法的基本原理。不足的是，单纯这样的分离方法特异性不足，容易受到氨基甲酰化蛋白、Schiff碱等的干扰。为了提高特异性，在分析前必须经过细致的前处理，尽可能分离纯化HbA0和HbA1c，细致的前处理过程也进一步降低了该分析方法的通量水平。

基于结构差异

1）亲和色谱

HbA1c与HbA0之间的结构差异为是否与葡萄糖结合，亲和色谱就是利用了色谱柱与糖基化部分的亲和力实现HbA1c的分离。目前的亲和色谱采用硼酸包被的色谱柱，糖化血红蛋白与硼酸具有亲和力，使得糖化血红蛋白保留在色谱柱上。但是葡萄糖与Hb的结合位点多样，不仅仅形成HbA1c，该方法得到的直接结果不可避免的偏高，为此需要对数据进行进一步的修正，以得到HbA1c的结果。

2）免疫法

利用HbA1c与HbA0的结构差异开发针对HbA1c的抗体，抗体靶向结合β链N末端糖化四肽或六肽基团，采用免疫比浊法或Elisa进行检测。这种方法相较而言，操作简单，容易自动化，不受电荷问题的影响，但是也面临着自身的局限性：非线性的校准曲线、特异性问题等。前者需要频繁进行校准，这在测量中引入更多的不确定因素；后者非特异性抗体结合的问题，导致免疫方法的准确度和重复度都有所欠缺。

3）酶法

蛋白酶切割β链释放糖化二肽，二肽与果糖基肽氧化酶反应，得到的过氧化氢用于定量HbA1c。酶法面临的问题与免疫方法类似。

HbA1c检测新方法

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是近年来发展起来的一种新型的生物质谱，通过“软电离”技术与飞行时间质谱的结合，为生命科学领域提供了全新的分析方法。不同于传统HPLC检测方法对HbA1c进行整体检测，MALDI的测量是将糖化血红蛋白拆分为游离的珠蛋白进行检测，可直接测量β链的糖化水平。因为是将糖化血红蛋白拆分检测，所以可以更清楚地了解血红蛋白变体对HbA1c的影响。