分析测试百科网 > 行业资讯 > 微信文章

一文了解靶向组学研究中的靶标-（附代谢组学、蛋白组学、糖组学案例，建议收藏)

核磁同位素学社

2023.3.24

组学研究中的靶标

-同位素标记(建议收藏)

组学研究是对生物体各类代谢过程及代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式。作为组学研究常用的检测方法，质谱 (MS) 和核磁 (NMR) 可以检测机体某一特定时刻代谢物在体内完成复杂代谢后的总量，而无法精确到代谢物所处的具体代谢通路。

目前，可通过在组学分析中引入放射或稳定同位素标记物示踪剂去推断其代谢路径。但放射性同位素对人体有一定危害，稳定同位素无放射性、物理性质稳定、对人体无害，因此更受科研人员的欢迎。稳定同位素标记也成为组学研究中最常用的靶标（代谢组学、蛋白质组学、脂质组学、糖组学。。。）

代谢组学（Metabolomics）

效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。

【研究案例】通过质谱测定，跟踪稳定同位素示踪剂的代谢物标记可以揭示其代谢途径。

G. D. Marijn Veerman 等人，用 100 ng/mL 的含氘同位素 (afatinib-d6, crizotinib -d5 and erlotinib-d6) 产品做内标，仅在 5 分钟时间就可以测定人血浆中所有化合物 (如 Afatinib，Alectinib，Crizotinib 和 Osimertinib) 的浓度范围，该方法有潜力用于临床前的药代动力学研究。

【研究案例】冠状动脉疾病(CAD)对精氨酸/一氧化氮(Arg/NO)途径的影响仍在继续研究中。为了加强对该领域的理解，Banfi和同事们开发了一种靶向MS代谢组学方法来量化人类血浆中的Arg/NO途径代谢物。该方法使用了一系列稳定的同位素标记标准(如13C7/15N4 L-同型精氨酸，D6鸟氨酸)，根据FDA指南进行了验证，并应用于不同级别/类型CAD的患者样本。尽管还需要更大的研究队列，但有意义的发现表明Arg/NO代谢物与急性心血管事件之间存在性别依赖的相关性。

蛋白质组学 (Proteomics)

过去十年来，质谱（MS）已经成为蛋白质组学研究的基础，是生物学家进行蛋白质组学研究的必不可少的工具。质谱仪具有从复杂的生物样品中鉴别出成千上万种蛋白质的能力，从而使科学实验发生了革命性的变化。在许多疾病的发展进程中(如癌症)，常伴随着某些蛋白质的表达异常。蛋白质组学就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。稳定同位素标记的方法，可以量化样品中的蛋白质浓度差异。因此同位素标记可用于对癌症生物标志物检测、鉴定和验证等。

【研究案例】美国宾夕法尼亚大学药学系 Matthew L.MacDonald,Eugene Ciccimaro,Ian Blair,Chang-Gyu Hahn靶向LC-SRM/MS定量哺乳动物突触蛋白Mouse Express®脑组织。使用一种LC-SRM/MS反应监测方法，该方法利用CIL公司的Mouse Express®脑组织L-赖氨酸(13C6,97%)对哺乳动物脑组织亚细胞部分中的突触肽进行靶向定量。该方法利用SILAM脑匀浆的膜制剂作为内部标准，促进了从小鼠脑组织分离的三个神经元亚组分(囊泡、突触前和突触后密度)的100多种蛋白的定量。

【研究案例】法国蒙彼利埃大学Audrey Sirvent, Serge Urbach, Serge Roche利用稳定同位素氨基酸Mouse Express®Lysine-13C6小鼠异种移植物实验分析人类癌症中的酪氨酸激酶信号。文中描述了一种新的蛋白质组学方法，使用Mouse Express®L-赖氨酸(13C6, 99%)小鼠饲料对人癌细胞异种移植的裸鼠肿瘤进行标记(MF-LYS-C)。肿瘤中发生的高从头合成蛋白率可能会在短时间内诱导异种移植肿瘤的高效标记。通过只给植入的小鼠喂食SILAC小鼠饲料，我们观察到一致的>88%的肿瘤蛋白组标记30天。然后使用这种方法来比较SRC阳性肿瘤。

【研究案例】稳定同位素示踪技术通常用于研究人类蛋白质代谢、生理和疾病。为了克服示踪剂输注方法的局限性，Hirsch和Church等人开发了一种口服“小口喂养”方法来量化全身蛋白质动力学的急性变化。使用sip剂量的稳定同位素标记氨基酸(如D5 L-苯丙氨酸，D2 L-酪氨酸)，测定了一段时间内人类血浆中蛋白质合成和分解的速率。这项初步研究证明了对全身蛋白质代谢的可靠测量，以及作为传统输注示踪技术的潜在替代方案的可行性。

【研究案例】稳定同位素标记的氨基酸在细胞培养（SILAC）方面就是一个很好的例子，该方法完美的将同位素标记与蛋白质结合，以便用质谱来研究蛋白质组学。在SILAC实验中，两种细胞生长在培养基中，其中一个有“轻氨基酸”（自然丰度），另一个是重氨基酸（同位素标记）（例如，未标记和L-赖氨酸·2HCl（13C6，99%）（CIL目录号CLM-2247）和L-精氨酸·HCl（13C6，99%）（CIL目录号CLM2265））。同位素标记的氨基酸代替了细胞培养中使用的天然氨基酸与所有新合成的蛋白质结合。在细胞分裂过程中，每一个特定的氨基酸都被对应的同位素标记氨基酸替代。这种方法的优势是两种细胞裂解后立即混合在一起，因此来自这两种细胞类型的蛋白质在相同的样品处理过程中的消化、纯化和分离步骤的实验条件完全相同。因为这个原因，SILAC通常被认为是蛋白质组学定量的金标准。

【研究案例】蛋白质组学是研究人类疾病中失调的蛋白质和翻译后修饰(PTM)的重要工具。小鼠模型是体内模拟人类疾病的主要手段.哺乳动物的稳定同位素标记(SILAM)是一种金标准定量方法。在SILAM中，对照小鼠被喂食同位素标记的氨基酸以产生重蛋白质样本。标记的参考样品与未标记的样品等量混合，并使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行定量。SILAM可以在大动态范围内进行准确定量，而不会受到等压标记中出现的比率压缩的影响。此外，与其他方法相比，SILAM可产生更多的标记蛋白，并允许在消化和富集之前混合样品，从而有助于对低丰度分析物进行准确定量。

在生物标志物筛选中，大规模的蛋白质定量应用于蛋白质组学领域，发现并验证疾病指标。这些检测指标通常用液相色谱(LC)-串联质谱(MS/MS)对血浆样本进行。为了协助研究人员的开发和应用，剑桥同位素实验室公司(CIL)提供PeptiQuant“Plus生物标志物评估试剂盒(BAKs)，用于血浆蛋白的LC-MS/MS检测。

脂质组学（Lipidomics）

脂质是普遍存在的分子，服务于多种重要的生物功能，包括能量储存（甘油三酯）、细胞膜结构和功能的调节(磷脂和胆固醇）、细胞内信号和激素调节。脂质组学即系统研究细胞、组织或生物体内所有脂质的学科。主要研究数千种脂质的类型、分布、功能、与其他生物分子的相互作用，以及它们在生理代谢、病理状态时的动态变化。涉及的分析技术包括脂质的提取、分离、液相层析、各种质谱、核磁共振波谱、荧光光谱等。对深入研究各种脂质在生物膜结构、能量转换、信号转导等方面有重要意义，同时在临床检验、疾病诊断领域也有应用价值。

脂质代谢异常可导致多种疾病，包括动脉粥样硬化、高甘油三酯血症和2型糖尿病。因此，了解脂质在体内的合成、调节和运输对于开发和改进新的治疗方法非常重要。稳定同位素已被用于研究脂质代谢的几个方面，包括：胆固醇、磷脂、低密度脂蛋白甘油三酯的合成与处理。

【研究案例】脂类合成的实验，使用稳定同位素标记的脂肪酸作为底物来研究小鼠体内脂质代谢的一些优点和实验思路。C57BL6小鼠用溶媒对照和全身性小分子微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）抑制剂治疗。一小时后，给小鼠注射150 mg/kg油酸、钾盐（13C18，98%）CP 95%（CLM-8856）和玉米油（图2）或20%TPGS（图3）。在给药示踪剂后的连续时间点提取血样并处理成血浆。将10µL血浆与90µL标记内标物的甲醇溶液混合，并用300µL戊醇进一步稀释。将样品短暂离心至颗粒不溶性蛋白质，并通过超高效液相色谱（与三重四极（Waters Xevo TQ）或四极飞行时间（Waters Synapt G2）质谱仪连接）分析5-10µL上清液。实验中，其中一种脂肪酸是全氘化棕榈酸(D31, 98%) (DLM-215)、硬脂酸(D35, 98%) (DLM-379)、油酸(D33, 98%) (DLM-1891)，其余两种是未标记的，或者三种脂肪酸都是全氘化的。将10µL血浆与丙酮在碱性pH下培养，以将血浆水中的氘与丙酮交换。然后用顶空气相色谱法结合同位素比值质谱仪（Thermo-Scientific）测量丙酮中氘的富集。

糖组学 (Glycomics)

糖基化是真核系统中最常见的蛋白质表达修饰之一。据估计60-90%的哺乳动物蛋白是糖基化的，事实上所有膜和分泌蛋白也是糖基化的。糖蛋白在生理代谢中通常起关键作用，例如细胞识别，信号传导，炎症和癌变。鉴于蛋白质糖基化的重要生理作用，众多研究团队致力于特异性聚糖的结构鉴定，表达蛋白的聚糖，以及对这些结构如何变化的详细研究，例如细胞分化或随着肿瘤细胞的发展。所有这些努力发展出了新的研究领域--糖组学。

【研究案例】用同位素标记糖可以让聚糖的细微变化可视化，可以比较每个生物样品中的精细结构。以 Comparative glycomics using a tetraplex stable-isotope coded tag 一文为例， Michael J. Bowman 等人使用四重稳定同位素编码标签，通过正相毛细管 LC-MS 和纳喷雾质谱，可直接在四个样品中直接比较其多糖组成。这证明了稳定同位素标记方法对于高质量的糖组学组成谱和精细结构分析的应用价值。

【研究案例】糖组学的一种体内标记的方法，这种方法类似于SILAC在蛋白质组学领域的应用。这种糖组学方法叫做IDAWG -（谷氨酰胺对氨基糖的同位素检测）-这基于谷氨酰胺侧链是氨基糖核苷酸合成中唯一的氮供体（图一）。因此，将L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）引入不含谷氨酰胺的培养基中，可产生N15标记的包括乙酰氨基葡萄糖、乙酰半乳糖胺和唾液酸在内的所有氨基糖类。这导致每个含N和O的聚糖、糖脂和胞外基质多糖的质量数增加+1Da。该方法通过培养在未标记和N15标记的谷氨酰胺环境中的小鼠胚胎干细胞蛋白质释放含N聚糖的实验得到了验证。这些实验的成功使我们预测，未来IDAWG技术将有助于细胞培养方面各种比较糖组学的研究。

【不懂就问】为什么氨基酸都是L型的？

在生物进化过程中,氨基酸自然选择为L型,糖类自然选择为D型,没有理由.只能认为在生物进化过程中,与酶的活性中心构型相配的,氨基酸只能是L型才相配.糖类只能是D型才相配.也许最初的生物也曾能够利用D型氨基酸或L型糖,但选择利用L型氨基酸和D型糖的生物在进化中成为优势物种,于是能够利用D型氨基酸或L型糖的生物慢慢地消失了,只剩下能够利用L型氨基酸和D型糖的生物,于是就成了现在这个样子。