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解析 ddPCR 绝对定量技术在 CGT 领域的分析应用
近年来，随着重组腺相关病毒 (rAAV) 载体广泛应用于体内基因治疗，其相关工艺研究样品的分析表征和质量控制越发受到审评机构重视。例如在 AAV 产品的临床用药安全和有效剂量研究中，样品的精确量化是数据分析的基础，关键质量控制包括滴度检测、纯度分析、靶序列鉴别等。病毒的基因组滴度是一个关键质量属性，同时也是临床给药量的重要基础，因此需要采用准确度较高的方法进行基因组滴度的检测。
目前检测基因组滴度常用的方法主要有 QPCR 法和 ddPCR 法。QPCR 法为相对定量方法，检测中需要采用标准品制作标准曲线，基于标曲计算基因组滴度，然而标准品的构型、稳定性、扩增位点等因素均会影响检测结果的稳定性和准确度。尽管可以在官方机构（如 ATCC）处购买到血清型2或者血清型 8 的 rAAV 质粒 DNA 标准品，但如何获得具有代表性的标准品，依然是行业共同的难题。
ddPCR 检测 rAAV 基因组滴度
ddPCR(droplet digital PCR) 技术的萌芽与发展给上述问题带来了解决方案。ddPCR 技术在 PCR 扩增前对样品进行微滴化处理，将含有待测样品的反应体系分成上万个纳升级的微滴。通过 PCR 仪对靶基因进行扩增和信号放大，再使用微滴分析仪根据检测通道对液滴逐个进行荧光检测。根据泊松分布原理及阴阳性微滴的分析，即可实现靶基因的起始拷贝数或浓度的测定。由于不需要标准曲线，ddPCR 方法被称为是绝对定量方法，可以避免使用 qPCR 进行 rAAV 基因组滴度检测的标准品相关问题，准确性更好。此外，就检测的批内和批间精密度而言，ddPCR 在检测 rAAV 基因组滴度方面也优于 qPCR，并且对样本或制剂含有的潜在反应干扰物具有更强的抗干扰能力，检测灵敏度可以达到 10 copies/ 反应或更低。
除了在绝对定量上得天独厚的优势，使用 ddPCR 对同一 rAAV 样品的不同位点进行标记，还能够实现 rAAV 样品的基因组完整性分析。如果可以进一步证明 rAAV 的完整基因组滴度与 rAAV 样品转导活性的关系，甚至能够将 ddPCR 方法发展成为转导活性检测的替代方法。
ddPCR 在细胞治疗产品和 mRNA 中的应用
除了在 rAAV 上的应用，ddPCR 的检测手段也可以应用在细胞治疗产品和mRNA的质量控制上。在细胞治疗产品中，Car 细胞拷贝数/插入基因阳性率对于治疗效果也是非常关键的质量属性，通过设计靶标基因和内参基因，使用 ddPCR 技术对 2 个基因进行绝对定量，避免标准曲线校准及扩增效率的影响，CAR 拷贝数结果准确度高，重复性好。并且也可以直接将细胞进行液滴包裹，形成单细胞的液滴，通过 PCR 扩增和液滴的信号收集，从完整细胞的角度进行插入基因的分析，获得细胞样品的插入基因阳性率检测结果，与 CAR 拷贝数检测一同在基因水平进行转导效率的研究，同时与蛋白水平流式细胞荧光分选技术（FACS）共同分析，可更好的支持工艺开发与优化，保证产品的有效性。
ddPCR 技术不仅在 AAV 和 Car-T 产品中具有广泛的应用，而且在质粒、活菌和 mRNA 等产品的质量分析中也扮演着非常重要的角色。Bio-Rad 与博腾生物合作，在 ddPCR 分子检测平台上成功开发出多种运用于rAAV、细胞产品（如Car-T、MSC）、mRNA、质粒和活菌产品的检测方法，在 ddPCR 分析方法开发和验证上具备充足的经验。
博腾生物分子检测平台 ddPCR 应用案例分享
1. 标准品定量及 AAV 基因组滴度检测
图1为标准品梯度稀释试验，结果表明定量限可低至 20 拷贝/反应，检测限可至 5~10 拷贝/反应，ddPCR 方法能更好的用于标准品的定量和残留检测。
图2为 AAV 基因组滴度检测的代表性图谱，通过对 AAV 样品的前处理，再通过 ddPCR 系统进行液滴生成并进行 PCR 扩增后读取液滴信号，结果表明使用 ddPCR 对病毒滴度进行检测，其结果阴阳性区分明显，易于分析，结果准确，并且相同样品不同天检测 CV 值 ≤10%。
2. 插入基因阳性率 /CAR 拷贝数检测
表1. 细胞完整率及插入基因阳性率汇总表
图3为插入基因阳性率检测的代表性图谱。通过加入细胞样品生成液滴实现液滴包裹细胞后进行检测，结果表明使用 ddPCR 方法对细胞进行检测时，细胞完整率高，干扰少，阳性率结果准确、稳定，细胞完整率 ＞97%。
图4 为 CAR 细胞拷贝数检测的代表性图谱。通过设计特异引物进行扩增，由图4可看出，各信号团聚团，无散点，易于分析，结果稳定可靠。
3. mRNA Poly A 尾完整性分析
图5. mRNA Poly A 加尾率
表2. mRNA Poly A 加尾率分析数据汇总
图5为 ddPCR 方法分析 mRNA Poly A 加尾率的代表性图谱。将 mRNA 分子进行液滴包裹，通过不同区域液滴占比，以及数据分析，计算出带有 Poly A 的 mRNA 和总 mRNA 数量。由结果分析，阴性样品无干扰，Poly A 尾检测专属性好，特异性强。并通过不同类型样品混合进行加标回收率实验，方法加标回收率在 70%~130% 之间，结果准确可靠。
博腾生物分析检测与咨询平台推出 ddPCR 方法开发和检测服务，为客户提供解决 GCT 产品分析质控难点的新思路。
拷贝数检测
残留DNA/RNA分析
标准品定量
基因编辑效率
突变检测，基因表达
mRNA ploy A与完整性分析
……1. AAV滴度检测
2.CAR拷贝数检测
3.CAR阳性率检测
4.DNA定量检测
5.CHO基因拷贝数检测
6.拷贝数变异、基因表达分析
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