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中药筛选抗氧化天然产物取得新进展
中医药是中华民族数千年来与疾病斗争的智慧结晶，具有丰富的临床实践经验和完整的理论体系，在中医药理论指导下组方或以中药为资源发现和研发创新药物，一直是中国新药创制的重要途径之一。多项研究显示源于中药与天然产物的活性物质具有抗氧化活性，但是如何筛选和高效评价哪些成分能通过抗氧化应激调控细胞命运仍缺乏有力工具。
自 20 世纪中期自由基衰老理论被提出至今，氧自由基在卒中、心肌缺血、神经退行性等衰老及相关疾病中的作用逐渐得到认识[1-4]。在各类活性氧中，超氧阴离子属源头物质，在氧化还原信号通路及氧化应激病理损伤事件中发挥重要作用，但超氧阴离子难以被标记追踪，如何以高时空分辨率原位追踪活细胞超氧化物动力学，对于发现能高效调控细胞内活性氧稳态平衡的活性物质具有重要意义[7-8]。
2023 年 3 月 14 日，浙江大学王毅教授及李新副教授共同通讯在 Nature Communications 发表题为 “1,2,4,5-Tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity” 的论文，开发了一类以 1,2,4,5-四嗪基为超氧阴离子特异性识别官能团的荧光探针，实现了超氧阴离子的高度选择性检测，并以该探针为基础，从天然产物库中运用高内涵筛选技术筛选到了具有良好的抑制超氧阴离子生成作用的中药活性成分。
作者首先设计并通过实验验证了适用于从 445 nm~ 600 nm （蓝色~红色荧光）发射的系列探针（图 1），确认了该类探针在分子层面、细胞层面对超氧阴离子的高度选择性，及其相较于传统检测探针如 DCFHDA（非选择性活性氧探针）、DHE （超氧化物特异性探针）在选择性、信噪比方面的优势（图 2）。
图 1，Tz 系列探针结构
图 2，四嗪类荧光探针与已知标记物 DCFHDA、DHE 在细胞水平对超氧选择性的对比。
Tiron：超氧阴离子清除剂；TEMPO：超氧化物歧化酶 （SOD）类似物，可有效中和活性氧。
接下来研究团队建立了高内涵抗氧化活性成分筛选流程，通过 150 μM 常用氧化剂——过氧叔丁醇（tBHP）诱导小鼠心肌细胞 H9C2 累积超氧化物，加入天然产物库中的 223 种化合物处理细胞之后，利用 F-Tz4（1μM）探针标记超氧化物含量，最后使用高内涵成像系统采集细胞图像并计算 F-Tz4 荧光强度和细胞数量，以此计算化合物对超氧化物累积的抑制率，筛选抗氧化活性成分（高内涵筛选流程见图 3）。
图 3，高内涵筛选流程
通过筛选作者从天然产物库中发现了 7,8-二羟基黄酮、青藤碱等中药活性成分具有良好的抑制超氧阴离子生成作用，特别是首次发现 5a-胆甾烷-3-酮能有效抑制过氧叔丁醇刺激导致的心肌细胞超氧阴离子积聚（图 4）。
图 4，新型荧光探针 F-Tz4 应用于体内外成像和高内涵药物筛选
最后作者利用小鼠模型，成功实现了氧化损伤心肌细胞和缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中超氧阴离子的跨尺度成像，并发现 5a-胆甾烷-3-酮能显著降低小鼠心肌缺血再灌注损伤。初步的机制研究表明，该化合物通过激活胞内 NRF2/HO-1 抗氧化通路发挥抗氧化作用（图 5）。
图 5，5a-胆甾烷-3-酮具有体内外心肌保护作用
该研究首次设计了 1,2,4,5-四嗪基超氧阴离子高度特异性荧光探针，利用 Molecular Devices 高内涵成像系统建立了抗氧化活性成分筛选模型，以此发现了新的活性化合物并初步探索了其体内外活性和机制，相关工作也为抗氧化先导化合物发现及中药药效物质研究提供了新的思路与工具。
随着《中华人民共和国中医药法》的颁布与实施，中医药将迎来前所未有的发展机遇。但是中药常常是活性组分或组分群通过多个靶点发挥作用，且这些组分之间具有配伍效应。这些特点对于阐述其作用机制提出了更高的要求，而高内涵筛选则能够快速高效地获得被筛药物对细胞所产生的实时快速和多维立体的生物效应信息，为系统研究中医药提供了一种新工具。既可以针对中药多组分、多成分的特点，进行高通量筛选，大幅度提高工作效率，也可利用微量、高效的特点，设计与分析配伍效应。应用高内涵成像分析系统开展中药作用机制和中药复方研究有广阔的发展前景，对推动中药现代化有重要意义。
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原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-37121-8
参考文献
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