荧光定量PCR
定义:荧光定量PCR是( realtime fluores-cence quantitative PCR,RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。
原理简述如下:
1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
2)SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
一般实验过程:
1 样品RNA的抽提
2 样品RNA质量检测
3 样品cDNA合成
4 梯度稀释标准品及待测样品
5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的模板
6 待测样品的待测基因实时定量PCR
7 电泳检测
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