技术服务详细描述

 MTT 可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan，在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解，然后通过酶标仪可以测定490nm 波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。CCK-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。可用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏等试验。

样品要求：

培养瓶培养细胞，细胞汇合度需达到70%，灌满新鲜培养基至接近瓶口处，封口膜缠紧封口。

细胞如在冻存管中需要足量干冰寄送。

服务项目及收费标准：

客户提供：

细胞（常规细胞系可由我公司提供，需要收取一定费用）

处理细胞所需药物

培养细胞需要如使用较为特殊培养基，也需要客户提供

服务说明：

MTT:

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μL，3000-10000个细胞/孔。

2.置37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。

3.加入适当浓度的受试化合物，继续培养适当时间。

4.小心吸去上清，加入90μL 新鲜培养液，再加入10μL MTT 溶液，继续培养4 h。

5.然后吸掉上清，每孔加入110μL Formazan 溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值。

6.同时设置调零孔（培养基、MTT、Formazan 溶解液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、Formazan 溶解液），每组设定3复孔。

CCK-8:

一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6 个复孔。

3、接种后培养至细胞贴壁，然后加CCK-8 试剂培养一定时间后测定OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X 轴），OD 值为纵坐标（Y 轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8 后的培养时间。）

二、细胞活性检测

1、在96 孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在37℃,5% CO2 的条件下）。

2、向每孔加入10μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD 值的读数）。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4 小时。

4、用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。

5、如果暂时不测定OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μL 0.1M 的HCl 或者1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24 小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增殖-毒性检测

1、在96 孔板中配置100 μL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24 小时（在37 ℃，5% CO2 的条件下）。

2、向培养板加入10μL 不同浓度的待测物质。在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或48 小时）。

3、向每孔加入10 μL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD 值的读数）。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

4、将培养板在培养箱内孵育1-4 小时。

5、用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。

6、如果暂时不测定OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μL 0.1M 的HCl 或者1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24 小时内吸光度不会发生变化。