T/GDCA 006-2021
化妆品原料对酪氨酸酶活性抑制试验方法 （体外法）
Cosmetic ingredients-Tyrosinase activity inhibition test method (in vitro)
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- 适用范围
- 1. 实验方法 除非另有说明，本文件所提到的受试样品的浓度均指其配制时的浓度。 1.1 受试物处理 阳性对照曲酸用PBS缓冲液稀释成：0.080 g/L、0.040 g/L、0.020 g/L、0.010 g/L、0.008 g/L、 0.005 g/L、0.002 g/L、0.001 g/L系列质量浓度梯度溶液。 受试物处理：受试物用PBS缓冲液梯度稀释成5个以上合适质量浓度的样品溶液。 1.2 试验分组 在96孔酶标板中设置溶剂本底孔（Ta）、溶剂反应孔（Tb）、样品本底孔（Tc）、样品反应孔（Td）。其中，Ta组为溶剂本底组，不加底物L-酪氨酸溶液、不加样品溶液；Tb组为溶剂反应组，加底物L-酪氨酸溶液但不加样品溶液；Tc组为样品本底组，不加底物L-酪氨酸溶液、加样品溶液；Td组为样品反应组，既加底物L-酪氨酸溶液又加样品溶液。每组做三个复孔。 1.3 试验步骤 参照表1试剂添加量，在各孔依次加入L-酪氨酸溶液、样品溶液/溶剂、PBS缓冲液，充分混匀，置 于37 ℃恒温环境下孵育10 min后依次在各孔加入20 μL的酪氨酸酶溶液，37 ℃混匀反应5 min±5 s 后即刻放入酶标仪，在475 nm波长处进行测定。 注：各孔从加入酪氨酸酶溶液到测定吸光度，保持时间一致（5 min±5 s）。 2. 结果计算 2.1 酪氨酸酶活性抑制率 2.2 半数抑制浓度（IC50 值） 以受试样品的浓度为横坐标，其对应的酪氨酸酶抑制率为纵坐标，绘制曲线图，拟合得到回归方程 （R2≥0.9）。根据回归方程，计算酪氨酸酶抑制率为50%时对应的样品浓度，即为该受试样品的IC50 值，同时计算其95%置信区间。 2.3 曲酸当量值 3. 试验有效性验证 每批次实验都需要加入阳性对照的测试，阳性对照曲酸的IC50应在0.005 g/L～0.03 g/L，则认为试 验系统有效。各组平行孔间的抑制率间的标准差（Standard Deviation，SD）值需≤15%，则认为试验平行性有效。加入酪氨酸酶溶液，37 ℃混匀反应5 min±5 s后即刻放入酶标仪，在475 nm波长处进行测定：±5s时间对测试结果IC50的影响，标准差SD值≤3%。 4. 结果判定 样品在某一受试浓度下的酪氨酸酶抑制率应表述为：抑制率平均值±抑制率间的标准差（SD）。 进行不同样品的酪氨酸酶抑制能力比较，在同一受试浓度下，抑制率越大代表该样品的酪氨酸酶抑 制能力越强。进行不同样品的酪氨酸酶抑制能力比较，IC50值越小代表该样品的酪氨酸酶抑制能力越强。进行不同样品的酪氨酸酶抑制能力比较，曲酸当量值越小代表该样品的酪氨酸酶抑制能力越强。