T/SYJ 0003-2023
黑木耳固体菌种制作技术规程

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标准号

T/SYJ 0003-2023

发布

2023年

发布单位

中国团体标准

当前最新

T/SYJ 0003-2023

 

 

适用范围

5　技术要求 接种须无菌操作，避免杂菌污染。 定期检查 菌种培养期间要定期检查培养菌种的培养箱温度和湿度；检查培养器皿的棉塞、盖子和培养基有无生霉现象，如发现异常则立即取出该管重新纯化，经培养后补上空缺；在低倍解剖镜下抽样检查有无螨虫等害虫，发现时须及时消除。 6　方法与步骤 菌种通常被分为3级。1级种也叫母种或试管种。可用组织分离法或孢子分离法获得母种。2级种也叫原种，是利用母种的菌丝体接入木屑培养基中所产生的菌种。3级种也叫栽培种，是利用原种再扩繁一次所产生的菌种，它直接用于生产，因此也叫生产种。 经过母种—原种—栽培种的不断扩大繁殖后，菌丝体的数量越来越多，越来越强壮，利用这样的菌丝体投入生产就可以生长出优良的子实体。 母种生产  6.1.1　母种培养基制备 采用PDA加富培养基制作母种培养基，配方：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、KH2PO41.5～2g、MgSO40.5～1g、10g蛋白胨、水1000mL。 配制方法：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，同时放入20g棉籽壳，煮沸20-30分钟左右至马铃薯酥而不烂时，用6-8层纱布过滤，取滤汁于锅中，加入葡萄糖20g、KH2PO41.5～2g、MgSO40.5～1g、10g蛋白胨、补水至1000mL，加入琼脂熔化，趁热分装于试管中，试管使用直径2厘米，长度20厘米的最优。 配制好的培养基用漏斗分装至试管，试管口、壁不粘培养基，塞橡胶塞或棉塞。每7支捆成一捆，管口用牛皮纸包好，直立于灭菌锅内，121℃、0.11～0.15MPa下灭菌30min，待培养基冷却至60～70℃，将其摆成斜面，斜面长度最好占管长的2/3左右比较合适，冷却备用。 6.1.2　菌种分离与转管培养 菌种分离方法有孢子分离法、组织分离法、菌丝体分离法。 孢子分离法是选用当年生无杂菌污染的鲜耳片，以黑、厚、大为佳，经无菌水冲洗几次，用丝线将耳片腹面向下吊挂，另一端吊挂在装有培养基的三角瓶口部，加棉塞封口，在25～28℃温箱中接收孢子并培养成菌丝体。 组织分离法是选用优质耳片，表面用75%酒精棉球擦拭2～3遍，用酒精棉包住耳片约2分钟，剪取远离耳基没有筋的 部位约0.2平方厘米。在无菌条件下，接入试管斜面培养基上，经25～28℃左右的温度培养长出菌丝体。 菌丝体分离法是从黑木耳的段木中分离菌丝体获得菌种的方法。切取火柴头大小的木块，经过消毒，在无菌条件下接入试管斜面，经25～28℃的培养就能长出菌丝体。 分离成功的试管母种，还可以在试管斜面培养基上扩大繁殖1～3次，这个过程称为转管或扩管，也叫传代培养。一般1支母种可转30～40支母种，从而满足生产上的需要。 转管培养：当培养基温度降至30℃以下时，于无菌室内接种，将菌种用接种钩接入空白斜面培养基，动作迅速、准确。切取菌种时选远离原老菌种的部位，一般培养基两端的活力最强，菌种块大小为1～2mm，块越小菌龄越一致。 在菌种分离与转管培养时，要在超净工作台上进行无菌操作，防止杂菌污染。分离或转管几天后在试管斜面上就会长出白色的绒毛状黑木耳菌丝。经过10天左右的培养，菌丝可长满斜面，这就是母种。 6.1.3　母种培养 母种培养条件为在恒温培养箱内（26±1）℃避光培养，10天左右菌丝即可长好，期间需要定时观察，挑出污染或死亡的母种。菌丝生长健壮、洁白、均匀一致、无杂菌污染的，为优良菌种。 原种制备 6.2.1　原种培养基制备 (1) 培养基配方。培养基配方为棉籽壳78%，麦麸20%，蔗糖1%，石膏1%。 (2) 配制方法。将棉籽壳、麦麸、石膏混合均匀，再加水拌料，使培养料的含水量达到60%左右。测定方法是用手紧握培养料，指缝间稍有水印而不成滴。 (3) 培养基装瓶与装袋。原种生产使用接种瓶。培养基配好后，即可装入三角瓶中，装至瓶肩，料面压平。培养料在瓶中要求上紧下松，中间使用木锥扎1个孔。瓶口内外要擦净，用棉塞/橡胶塞封口。 (4) 培养基灭菌。原种装瓶再装入铁筐或塑料筐内准备灭菌。灭菌方法采用高压蒸汽灭菌。采用高压蒸汽灭菌时，锅内在0.15兆帕压力下(锅内温度127℃)灭菌1.5小时。 6.2.2　原种接种 原种是由母种扩接到原种培养基上而得到的菌种。 经过灭菌后的接种瓶或袋，待料温降到30℃以下后，搬入超净工作台或接种室进行接种。接种前，将接种器具、物品搬入接种场所。这些器具和物品主要有接种匙、镊子、酒精灯、酒精棉球、菌种、待接种的料袋。物品放好后，再用紫外线或气雾消毒剂进行熏蒸消毒，40分钟后方可使用。 接种时，先点燃酒精灯，将接种用具、菌种表面、接种人员双手用75%酒精擦抹，再将接种针或镊子、菌种棉塞在火焰上灼烧消毒，然后在火焰上将管(瓶)口棉塞/橡胶塞轻轻拔出，斜对火焰，就可进行正式接种。接原种时将每支母种斜面用接种针横划成4-5段，每瓶原种培养基接入一段；接栽培种时，每个培养基瓶内用镊子挟入一小块原种，即每瓶原种一般可接栽培30-40瓶或40-50瓶。 6.2.3　原种培养 培养场所在使用前也要用气雾消毒剂进行熏蒸消毒。 （1）培养温度：一般放置在22℃-25℃的温度下培养，25-60天就可长满瓶。 （2）培养湿度：室内相对湿度保持在60%-70%之间，经常保持室内空气新鲜，以利菌丝的生长。如室内空气湿度过大，应在地面上撒些石灰粉，降低湿度，防止病虫杂菌孳生。 （3）菌种瓶直立放置：因接入的菌种块还未生长固定，如卧倒叠放，菌种块易落到瓶侧，影响菌种萌发。如生产菌种数量多，应待菌丝萌发并封口后，便可卧倒叠放，以充分利用空间。 （4）检查去杂：从菌种萌发定植封口开始就要经常检查有无杂菌污染，发现有杂菌的要及时检出，一般检查工作继续到菌丝体覆盖整个培养基表面为止。 （5）保持清洁卫生：培养室内外要经常保持清洁卫生，同时培育期间每隔7-10天，在室内外及瓶口棉塞上喷1%的敌敌畏或其他杀虫药液一次，防止害虫发生。菌种长好后放在低温、干燥、清洁处避光保藏，准备使用。 栽培种制备 栽培种是由原种扩接到栽培种培养基上而得到的菌种。 6.3.1　栽培种培养基制备 栽培种培养基配方及制作方法与原种相同，但栽培种一般用塑料袋生产，高压蒸汽灭菌适合使用聚丙烯袋。袋的大小以36厘米×16.2厘米×0.005厘米较为适合。装袋时要保证松紧适当，装袋后使用窝口机进行窝口，插入接种棒。装袋时料袋要轻拿轻放，防止沙粒或杂物将袋刺破引起污染。栽培种培养基装袋后，装入塑料盘中，进入大型高压灭菌锅锅内在0.14兆帕压力下，锅内温度121℃，灭菌3.5小时。 6.3.2　栽培种接种 栽培种接种方发与原种接种方法一致。 6.3.3　栽培种培养 栽培种培养与原种一致，但是栽培种不宜再做菌种扩大繁殖。 无菌接种操作程序 无菌操作一般在超净工作台、接种室中进行，工作量较小时使用超净工作台，而如制作栽培种等工作量较大时需在接种室中进行。操作步骤如下： 6.4.1　超净工作台的使用规程 首先将超净工作台、接种室收拾干净，放入培养基、菌种、接种用具。超净工作台使用紫外光灭菌30分钟，菌种需要用报纸遮盖，防止紫外光杀死菌种。接种室用气雾消毒粉进行熏蒸消毒，每立方米空间用量1包(5克)，置于容器中点燃，保持40分钟以上。用75%酒精棉擦抹双手。点燃酒精灯，接种工具灼烧灭菌后开始接种。接种时一定要保持无菌操作，培养基接种后移到培养室进行培养。 6.4.2　接种室的使用规程 ①在每次使用前1小时，将所需物品移入接种室，按一定位置摆好，并检查是否齐全。用5%石炭酸溶液在接种室和缓冲室喷雾后，开启紫外线灯照射40分钟； ②关闭紫外灯20分钟后进入缓冲室，穿上无菌工作服、鞋、戴好口罩、工作帽，然后用2%煤酚皂液将手浸洗2分钟； ③进入接种室，并用5%石炭酸溶液重点在工作台的上方和附近的地面上喷雾。 ④接种前，用75%的酒精棉球擦手，然后按常规在火焰上进行各项操作。操作时动作要轻捷，尽量减少空气波动，两人操作时要配合默契。用完的火柴杆、废纸不要扔在地上，应放在专用的容器里； ⑤工作结束，及时取出接种材料，然后清理台面，将废物拿出室外，再用5%石炭酸全面喷洒，或打开紫外线灯照射半小时； ⑥接种时如遇棉塞着火，用手紧握即可熄灭，或用湿布扑灭，切勿用嘴吹灭，以免扩大火焰。如遇培养物或有菌容器打碎散落，应及时用抹布沾5%的石炭酸溶液，收拾擦拭，再用酒精棉球擦手后才可继续操作。

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