实战：食品中残留有机物定量分析中的那些“坑”

前一篇博文《食品中残留物定性首选色谱-质谱联用技术》介绍了应用色谱-质谱联用技术对食品中残留有机化合物的定性分析。本文同前一篇博文一样，以欧盟指令和国家标准规定为依据，结合实际检测工作，就色谱及色谱-质谱定量时应注意的一些问题和体会做一交流。

按照前文介绍的色谱-质谱检测方法已对食品中某残留被测物定性无误了，接下来还要对检出物进行定量分析。目前根据欧盟指令，将残留物分为禁用物质和限用物质。禁用物质执行最低要求执行限（Minimum Required Performance Limits，MRPL），如：《农业部公告禁用兽药目录》等标准和法规。对于这类物质基本上是以检验标准方法检出限作为是否检出的判定依据。限用物质执行最大残留限量（Maximum Residue Limits，MRL），如：《GB 2760—2014，食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》、《GB 2762-2012 食品安全国家标准 食品中污染物限量》、《GB 2763—2016，食品中农药残留最大限量》等标准和法规中都不仅规定了要检测的物质，还规定了被测物的检出限（MRL）。被测物最终结果检出的值超过标准规定的MRL值将视为检出，即为阳性结果。因此，被测物准确定性后的准确定量在最终出具的检测报告中同等重要。

在《执行关于96/23/EC指令分析方法程序和结果解释的欧盟委员会2002/657/EC指令》、《食品和饲料中农药残留分析质量控制和验证程序SANCO/12571/ 2013指令》两个指令及《GB/T 27404—2008，实验室质量控制规范 食品理化部分》国家标准中，对残留检测方法的检出限、准确度、精密度、回收率等分析学指标做了详细规定。根据这些规定并结合实际工作就定量时应注意的事项归纳如下：

1.      标准物质。

根据《食安法》第五十七条规定：“食品检验机构按照国家有关认证认可的规定取得资质认定后，方可从事食品检验活动。”在实验室认证认可评审中标准物质（过去实验室称为标准品）是重要考察因素之一，它直接关系到最终定量检测结果是否准确。所以，实验室管理手册都会有专门一节描述对标准品的管理和使用。

认证认可实验室采用的残留分析用的标准物质均为有证标准物质（Certified reference material, CRM），产品应附有企业通过的质量认证证书、已知纯度、产品检测报告、不确定度、有效期证书和产品说明书等。实验室应建立标准品目录，记录接收日期登记、验收记录和使用记录等。要按照所附产品说明书的保存条件存放标准品，绝大部分标准品都要求低温下储存，最好存放在冰箱里，避光和防潮，最大限度地减少降解率。很多标准品在前述条件下可以储存较长时间，大于供应商的有效期。在国外，通常用新有证标准物质对其纯度进行检验后若没有变化是可以继续进行使用的，只要有完整的测试报告和记录。但若某一被测目标物检出需要精确定量时最好用新标准品。不过在国内实验室认证评审时，有些评审员只接受带原厂证的标准品，而不接受实验室自己检测验证过的标准品。所以在国内实验室认证前最好还是换新的标准品吧，避免不必要的麻烦。虽然这样做造成了浪费和污染。

配制标准（包括内标标准）储备液称量标准品时一般采用万分之一天平称量，称取量不少于10mg。储备液容器标签要标明品名、浓度、溶剂、配制日期和配制人并在有效期内保存于低温避光容器内，还应该防止溶剂损失和防潮。有一种专门用于存放标准储备液的双磨口储液瓶（见图1.），价格比较贵，但重要的标准储备液可以考虑选用。通常根据分析方法选择溶解、定容溶剂。在建立新方法时，要根据被测物和检测仪器特性合理选择溶解、定容溶剂。工作液系列的配制要根据限量要求和方法学规定确定，容器标签同样必须标明名称、浓度、溶剂、配制日期和配制人并在有效期内保存于低温避光容器内，还应该防止溶剂损失和防潮。

              

图1. 存放标准储备液双磨口储液瓶

2.      有证标准样品

有证标准样品是指特定样品中分析物被赋值，例如：鸡肉中的氯霉素。由于有证标准样品被视为是特定样品中特定分析物的定值，所以它主要用做日常检验的质控样品。与标准品添加到样品中做回收相比，采用标准样品是对分析方法全过程进行验证，而标准品添加回收实际上没有验证提取效率这一步。因此，考核一个新检测方法设计的是否合理，特别是提取效率是否满足检测要求，最好选用有证标准样品。有证标准样品通常是由国家计量部门或由国家计量部门批准、颁布并授权生产。购买时一定要仔细查看证书的有效性。有证标准样品虽然是最理想的质控样品，但是目前能提供的品种还比较少，日常检测质控更多的还是采用标准品添加回收。

3.      定量方法

（1）         内标法。定量首选方法。若是色谱分析内标物可以考虑选择同系物，若是色谱-质谱分析则首先考虑选择与被测物化学结构相同的稳定同位素做内标物。内标物应在分析实验的第一步（一般是提取）就加进去，这样可以校正整个分析过程（除提取误差外）所产生的系统误差。有两个小建议供参考：其一，对于多残留分析需要选择多个内标法（对于残留兽药最好是一对一），用一个内标物校正所有被测物质往往不如用外标法定量更准。其二，对于检测的被测物绝对回收率低于方法学规定的回收率要求，但回收率较稳定，可以采用内标法用相对回收率将其回收率提高到方法学规定要求范围内。而且内标法可以提高残留分析方法的重现性，在没有内标的情况下，重现性RSD常常会高于20%；而当使用内标时，RSD能降低到5%左右。在用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测时常常由于基质效应，回收率有时会较低，用内标法可以校正达到方法学要求。虽然良好的实验室规范（GLP）认为衡量一个方法的是否可用应该用绝对回收率，但是，随着检验工作量的增加，随着仪器性能的提高，日常检测用相对回收率完全可用满足检测需求，同时提高了工作效率，降低了工作强度。

（2）      外标法。采用外标法定量，通常要做定量校准曲线。残留分析建立的曲线至少应有5点（在接近方法检出限时可以包括零点）。其中，校准液系列的最低点浓度应为最低校正水平（LVL），该点通常与分析方法的最低检出限相当，或者为低于相应报告限（RL）的浓度水平。RL不能低于最低定量限（LOQ）。在应用标准曲线定量时需关注这几个问题：

（i）         检测的被测物含量必须在定量曲线范围内，接近方法检出限曲线的浓度范围至少覆盖一个数量级。

（ii）       应描述曲线的计算公式，曲线数据拟合度应满足指令和标准要求。

（iii）     应考虑曲线参数的适用范围。例如，采用LC-MS/MS检测时往往会有基质效应，所以，当以某一种基质液配置的定量标准曲线可能不适用另一种基质的定量，如：牛肉基质的氯霉素标准曲线，可能不适用虾中氯霉素的定量。如图2. 所示，由于基质效应的影响，在相同的响应值时，标准液与实际样品的含量可能是不同的。不同基质的样品响应值也会存在差异。B含量可以比A（标准品）高，也可以比A低。

              

图2. 由于基质效应的影响，在相同响应值时标准液与实际样品的含量可能不同

（3）      标准曲线添加法。有些被检测的有机污染物在食品中普遍存在，如烘焙食品中的丙酰胺，很难找到空白样品，这时样品中残留物的定量通常采用标准添加法。另外，现在认可实验室都要参加相关的实验室比对实验或盲样测试，一般仅提供测试样品，并不提供对应的空白基质样品。这时要得到比较好的定量数据可以考虑采用标准曲线添加法。

4.      补充几个与定量分析相关的问题

（1）      要得到食品中残留有机物定量分析的准确数据，实验室应有运转正常的质量保证体系，确保分析过程的每一步都有相应的质量控制。整个分析过程包括：取样、样品传递、制样、储存、提取、净化、标准物质及标准溶液（或是带证标准样品）、仪器检测等，都是受控的。所有步骤都会对最终的定量准确度产生影响。

（2）      标准液配制要注意：

（i）          避免使用易挥发的有机溶剂，如乙醚等。

（ii）        目前国内许多实验室采用容量瓶储存标准液，由于有些容量瓶的磨口密封性不是很好，所以通常需要用封口膜再密封一下。

（iii）      多种农残储备液混合时，要注意避免可能存在的彼此反应。

（3）      残留分析基本上都有相关法律法规限量要求，因此，分析方法也都对应有推荐标准或指令，最终出具的结果数据必须完全符合相关方法学标准规定的要求。

（4）      由于残留分析含量都很低，在整个分析过程中都要避免交叉污染。所以，为保证数据准确和对异常数据的判断，每批分析都必须带质控点，即：试剂空白、样品空白、质控样品（样品标准添加回收）、标准曲线（内标标准）等，这些数据可以对最终数据准确度的判断提供帮助。

（5）      最好建立质控图，有助于发现异常数据。