柱色谱-紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含量

作者:杨美华，卢兖伟，匡岩巍，孙仲诒，吴祖泽

摘 要：目的 建立广金钱草中总黄酮的含量测定方法。方法 选用测定波长272 nm，以6-C-葡萄糖-8-C-木糖洋芹素(vicenin-2)为对照品，采用柱色谱-紫外分光光度法对不同来源的广金钱草进行了总黄酮的含量测定。结果vicenin-2在10.8～25.2μg/mL具有良好的线性关系，回归方程为Y=0.0309 X+0.016(r=0.9999)，平均回收率为100.82%，RSD为1.3O%。结论 该方法操作简便，结果准确，重复性好，可用于广金钱草的质量控制。

Quantitative determination of total flavonoids in Desmodium styraci folium by column chromatogram-UV spectrophotometry

Key words：Desmodium styracifolium (Osbeck)Merr.;vicenin-2;total flavonoids;quantitative determination：column chromatogram-UV spectrophotomatry

广金钱草为常用中药，来源于豆科山蚂蝗属植物金钱草Desmodium styracifolium (Osbeck)Merr.的干燥地上部分，收载于《中华人民共和国药典》2000年版一部 。具有清热除湿，利尿通淋之功效。含有黄酮类、皂苷类、鞣质和生物碱等成分。药理研究证明，广金钱草总黄酮具有预防草酸钙结石形成和复发的作用，另外还有显著的抗炎作用，增加冠脉血流量等。《中华人民共和国药典》只收载了广金钱草中黄酮、生物碱的定性检查方法。本实验首次以黄酮中含量较高的成分6-C-葡萄糖-8-C-木糖洋芹素(vicenin-2)为对照品，采用柱色谱-紫外分光光度法，测定了广金钱草中总黄酮的含量，为广金钱草原药材的质量控制提供了依据。

1 仪器与试药

UV-2501PC (岛津)UV-Vis光谱记录仪，TP-300超声波清洗机。

vicenin-2对照品自制，采用自身对照HPLC法测得含量为98%以上。所用试剂均为分析纯。柱色谱用聚酰胺(60～90目)(江苏临江试剂厂)。

广金钱草药材购于海南省、广东省和广西省不同的药房和医药公司。经北京大学药学院陈虎彪教授鉴定为豆科山蚂蝗属植物D.styracifolium(Osbeck)Merr.的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 测定波长的选择：对照品溶液和供试品溶液(上柱前及上柱后)在200～400nm 进行扫描，发现均在272及339 nm附近有最大吸收峰，但波长272nm处的响应值比波长339nm波长处的响应值大，故选择测定波长272nm。

2.2 对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥24h的vicenin-2对照品适量，加50%乙醇制成36μg/mL的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备：取本品粉末(过二号筛)0.5g(同时另取本品测定水分)，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加80%乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率440W ，频率50Hz)60min，取出，放冷，再称定质量，用80%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，蒸至近干，残渣加50%乙醇使溶解，放冷，通过聚酰胺柱(60～90目，1g，内径1cm，湿法装柱)，以50%乙醇洗脱，收集洗脱液并定容至100mL，摇匀，作为供试品溶液。样品含量均以干燥品计算。

2.4 线性关系考察：精密吸取上述对照品溶液3，4，5，6，7 mL分别置于10 mL量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，以50%乙醇为空白对照，于272nm 处测定吸光度，以vicenin-2溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y=0.0309X+0.016，r=0.9999。结果表明vicenin-2在10.8～25.2μg/mL与吸光度具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验：取一定浓度供试品溶液连续测定5次，测定吸光度，其RSD值为0.38%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验：取对照品及供试品溶液于室温分别放置0，30，60，90，120min测定吸光度，计算对照品及供试品的RSD分别为1.20%，0.74%。表明对照品及供试品溶液在2h内稳定。

2.7 重复性试验：精密称取同批样品5份，按含量测定方法进行测定，平均含量为2.24%，RSD为1.70%，表明重现性良好。

2.8 回收率试验：精密称取已知含量的广金钱草药材(过二号筛)5份，分别精密加入vicenin-2对照品适量，各份均按含量测定方法进行测定，平均回收率100.82%，RSD 1.30%(n=5)。

2.9 样品测定：按2.3项制备供试品溶液，对11批来源不同的广金钱草进行了总黄酮的含量测定。

3 讨论

3.1 测定方法的选择：黄酮类化合物含量测定方法有比色法、紫外分光法等。很多文献报道总黄酮的含量测定均以芦丁为对照品，采用NaNO2A1(NO3)3-NaOH为显色剂进行含量测定。郭亚健等选择了一些黄酮类成分和非黄酮类成分，照上述比色法在波长400～700nm 进行扫描测定。结果表明，有些黄酮类物质在500nm 处无最大吸收或吸收很弱，而有些非黄酮类物质在500nm处有最大吸收或有较强吸收。实验结果说明以芦丁为对照品，以NaNO 2-A1(NO3)3-NaOH 为显色剂，于500nm进行总黄酮含量测定的方法专属性不强，有局限性，准确性较差。石淋通片系广金钱草的浸膏片，席先蓉等曾参照《中华人民共和国药典》测定槐花中芦丁含量方法，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色剂，对石淋通片中黄酮类化合物的含量进行了测定。结果未见供试品溶液在500或510nm 处与对照品有相似吸收峰，显然用该法测定石淋通片中总黄酮的含量是不妥的。笔者也曾采用上述方法，以芦丁为对照品，对广金钱草原药材进行总黄酮的含量测定，实验结果与席先蓉等一致。此外，还以vicenin-2为对照品，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色剂，采用上述方法，对广金钱草中总黄酮的含量进行了测定，结果仍未见对照品溶液和样品溶液在500或510nm处有吸收峰，该结果亦表明以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色剂的比色法不能用于广金钱草中总黄酮的含量测定。从实验结果可知，以广金钱草黄酮中含量较高的成分vicenin-2为对照品，采用柱色谱-紫外分光光度法测定其总黄酮的含量，操作简便，重现性好，结果准确。

3.2 提取溶剂和提取方法的选择：实验中比较了50%甲醇，30%甲醇，80%乙醇超声提取或加热回流提取样品，结果以80%乙醇超声提取的样品杂质量少，操作简便。

3.3 提取时间的确定：采用80%乙醇超声提取样品，分别测定了不同提取时间样品中总黄酮的含量，结果在以60min时总黄酮含量最高。

3.4 洗脱溶剂和体积的确定：实验中曾采用甲醇5%～30%，乙醇10%～50%洗脱，结果以50%乙醇75mL 即可洗脱完全。

3.5 本方法简便快速，准确度高，重现性好，为《中华人民共和国药典》广金钱草的质量标准的进一步提高提供了依据。

References：

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