在大肠杆菌中表达重组蛋白的常见问题与解决办法

大肠杆菌表达系统是目前重组蛋白表达与纯化最常用系统，其拥有众多不同类型的载体和受体菌株，已被发展成为一种安全的基因工程实验体系。虽然该系统具有遗传背景清晰、生长迅速、培养方便、表达量高等诸多优点，但是依然存在容易形成包含体、缺乏翻译后修饰系统、密码子偏爱性和膜蛋白表达困难等诸多问题。其主要问题如下所述：

1、目的蛋白自身属性对可溶性表达的影响

不同蛋白在原核表达系统中的表达状态具有明显差异，蛋白的分子量、蛋白结构的复杂程度蛋白折叠具有很大影响。蛋白相对分子质量越大、结构越复杂，越容易形成包含体或蛋白聚集体，其在细胞中可溶性表达的比例也越小。重组蛋白一级结构的氨基酸组成（尤其是疏水性氨基酸）及排列顺序，也是影响可溶性表达的重要因素。

解决方法：可以在软件分析的基础上，采用截短突变和定点突变手段，在不影响目的蛋白功能的情况下对其进行改造，提高其可溶性表达的水平。

2、表达条件对目的蛋白可溶性表达的影响

表达宿主与表达载体的组合、共表达分子伴侣、诱导表达条件等也是影响目的蛋白可溶性表达的重要因素。 

解决方法：

（1）选用中等强度启动子或这带有促进可溶性表达标签的表达载体，并选用具有共表达分子伴侣的细胞作为表达宿主等方法可减少包含体的形成。

（2）在培养基中添加一些化学添加剂，如表面活性剂、渗透压调节剂等，可以促进蛋白质的折叠，提高可溶性蛋白的比例。

（3）降低诱导剂IPTG的浓度或选用诱导程度较温和的乳糖作为诱导剂，降低诱导表达时菌体的生长温度和诱导时间，都可降低重组蛋白表达的速度，有利于蛋白质的正确折叠，同样可以提高可溶性蛋白的比例。

3、目的蛋白对宿主细胞的毒性

为了减少对宿主细胞的毒性，可以组成型表达抑制蛋白（如lac表达系统中采用lacI、lacIq等）、采用调节严谨的启动子（如PBAD）、选用低拷贝质粒、组成型表达T7 lysosyme（如pET系统与pLysS/E共表达）、或者在培养基中添加1%的葡萄糖（lac表达系统）等。 

也可以将有毒目的蛋白分泌到胞外或以包含体形式进行表达，形成的包含体可以在体外进行复性。

4、密码子优化

大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，目的基因密码子的种类会影响基因的表达。

解决方法：

（1）通过点突变等，将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞高频出现的同义密码子；

（2）人工合成经过密码子优化的编码基因序列；

（3）采用共表达稀有密码子tRNAs编码基因的宿主细胞，如BL21（DE3）CodonPlus-RIL、BL21（DE3）CodonPlus-RP、Rosetta（DE3）等。

5、mRNA稳定性

外源基因mRNA的稳定性对目的蛋白的表达水平具有重要的影响。可采取下列两种措施保持mRNA在宿主细胞内的稳定性。

解决方法：

（1）减少外切核酸酶可能对外源基因mRNA的降解；

（2）改变外源基因mRNA的结构，使之不易被降解，在外源基因下游插入REP顺序或其他反转重复顺序，可稳定mRNA，提高表达水平。

6、表达产物的稳定性

作为受体菌的大肠杆菌存在着各种类型的蛋白酶，外源基因在大肠杆菌表达后很容易被细胞识别为异己蛋白而被降解掉，这是造成外源蛋白产物不稳定的主要原因。

为把外源基因产物在受体细胞中的降解控制在最低水平，常采取以下策略：

解决方法

（1）采用分泌型表达系统

目标蛋白在细胞质中最易受到酶的降解作用，而使产物分泌到周质空间或培养基中，则可避免水解酶对表达蛋白的降解

（2）采用某些蛋白水解酶缺陷型菌株作为受体菌

绝大多数不稳定的重组异源蛋白是被大肠杆菌蛋白酶La和Ti降解的，这两种蛋白酶分别由lon和clp基因编码，lon- 和clp- 突变株可以显著增加细菌自身某些蛋白质及异源蛋白的稳定性，因此常被用作表达的宿主菌。

（3）将目标基因进行融合表达或串联聚合表达

将目标基因表达为融合蛋白的一部分，融合蛋白形成杂合构象，能在较大程度上封闭外源蛋白分子上的水解酶作用位点，从而增加其稳定性。

对于小分子多肽类外源基因产物，由于它们缺乏有效的空间结构而在大肠杆菌中半衰期很短，采用串联聚合表达可以弥补上诉缺陷。

（4）对目标蛋白序列中的蛋白水解酶敏感区域进行改造

N端Pro—Glu—Ser—Thr序列（即PEST序列）是胞内蛋白酶的超敏感区。据此，在目标蛋白N端加装稳定氨基酸序列，或改造不利于稳定性的PEST及类似序列，也是提高目标产物稳定性的对策。

若目标蛋白序列含有特定的蛋白酶识别切割位点，可以在不改变目标蛋白功能前提下，定点改造序列中某些氨基酸残基，以消除蛋白酶的切割位点，保护目标蛋白不被降解。