关于蛋白等电点的谈论：）

上一篇 / 下一篇 2007-07-19 22:25:33/ 个人分类：蛋白质组

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一个小师妹最近给我发了封信，觉得她的问题比较有代表性，帖出了来供大家讨论：
——————————————————————————————————————
XXX:
你好！

  我在用PMF检索小麦蛋白，但是我检索到的蛋白的等电点，不符合我在双向电泳中做出来的。怎么办？

  谢谢！
                                 XXX
回信（节选）________________________________________________________

  数据库里的蛋白等电点是理论值，是根据氨基酸序列用相关软件计算出来的，只是提供一个参考，和实际值应该有出入，可以不管它。

严格的讲，一个蛋白的等点只能有一个，但用不同的方法去测量会有差别，同一个蛋白的不同空间构像也会引起等电点的改变，情况比较复杂。在二维电泳上，也可能是有蛋白的降解，或是不知道的翻译后修饰（比如磷酸化），导致等电点发生变化。

回答完毕。如果还有兴趣，可以看看科学出版社的《蛋白质化学与蛋白组学》上11页的“蛋白质的等电点测定”一节。

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TAG: proteome 蛋白质组等电点蛋白质双向电泳

firefox发布于2007-07-18 00:58:39: 说得好！蛋白质组学分析本身是一个复杂的工作。需要综合运用各种实验结果去推断。其实，我常把蛋白质的鉴定比做公安中识别罪犯。如果，我们只知道一个特征，比如：这个蛋白叫作“张三”，恐怕数据库检索的结果给出的有千千万，如果我们知道更多的特征，这里，我们称为PMF（指纹），或者更多的关于序列的信息，识别的、尤其是唯一鉴定的可靠性就会大大增强。

snow_white发布于2007-07-18 00:59:46: haha，理论一定要联系实践嘛！

mass发布于2007-07-18 01:01:15: 来点基础的：

等电点：如果调节溶液的PH值使得其中的氨基酸呈电中性，我们把这个PH值称为氨基酸的等电点：PI。

PI是氨基酸的重要常数之一，它的意义在于，物质在PI处的溶解度最小，是分离纯化物质的重要手段。

等电点的计算：对于所有的R基团不解离的氨基酸而言（即解离只发生在α-羧基和α-氨基上），计算起来非常简单：

PI＝（PK1’+PK2’）/2

若是碰到R基团也解离的，氨基酸就有了多级解离，这个公式就不好用了，比如Lys、Glu、Cys等。aa Cys Asp Glu Lys His ArgPK’α-羧基 1.71 2.69 2.19 2.18 1.82 2.19PK’α-氨基 8.33 9.82 9.67 8.95 9.17 9.04PK’-R-基团 10.78（-SH） 3.86（β-COOH） 4.25（γ- COOH） 10.53（ε-NH2） 6（咪唑基） 12.48（胍基）

在这种情况下可以按下面的步骤来计算：

1）由PK’值判断解离顺序，总是PK1’< PK2’< PK3’< …，即谁的PK’值小，谁就先解离。

2）按照解离顺序正确写出解离方程式：简式，注意解离基团的正确写法。

3）找出呈电中性的物质，其左右PK’值的平均值就是氨基酸的等电点：PI＝（PK左’+PK右’）/2

以Lys为例：在黑板上用简式演示3）
等电点的测定：等电聚焦法：这是一种特殊的电泳，其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液，然后将氨基酸点样，只要该处的PH与氨基酸的PI不同，则氨基酸就会带电，PH值>PI时，aa带-电；PH值<PI时，aa带+电。通电后，氨基酸就会移动，直到某处的PH＝PI，氨基酸才呈电中性，不再移动，因此，可以测出PI。

等电点沉淀

所有的氨基酸均为两性物质，亦即它们至少含有一个酸性基（carboxyl）及一个碱性基（α-amino）。这些可游离的团基在pH变化时，因释出或接受质子而可充当弱酸或弱碱，其离子化特性与其它物质一样遵守Henderson-Hasselbalch方程式：

pH = pKa + log10 [未质子化的形式（碱）] / [已质子化的形式（酸）]

即
pH = pKa + log [A-] / [HA]

氨基酸可以三种形式存在，即正电荷（cation）、两性离子（zwitterion）或双极性离子（dipolar ion）及负电荷（anion）等三种，若在酸性溶液中带正电荷，则在碱性溶液中带负电荷。

若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。

因为净电荷为零，净电斥力不存在的缘故，大部份蛋白质於等电点的pH值下，其溶解度最小。相反的，当溶液的pH值低於或高於pI，所有蛋白质分子所带净电荷必为同号，彼此之间有相斥力，不会凝结。所以，将pH调到等电点的大小，则大部份的蛋白质将会沉淀，这种现象可以应用於估算某蛋白质的等电点。